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(無題) 削除/引用 No.4530-11 - 2007/07/16 (月) 21:23:12 - poink 適切なゲルの組成を選択している（以前うまくいっていたようですので）のにゲルの下半分がスメアになってしまう、、、ということはやはり「ゲルの出来方」に問題があるような気がしてなりません。高い室温での重合はよろしくないようですので、まずはカナマイシンさんのように重合開始前に溶液温度を低くコントロールしてみるのが良さそうですね。注入前のゲル板も涼しいところに準備しておいた方が無難でしょうかね。頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.4530-10 - 2007/07/16 (月) 19:28:11 - シン ＞poinkさん いまだ解決していません。 Lisaさんが言うようにバッファーを変えてみようとは思いますが、 以前はうまくいっていたので別のところに原因があるような気もします。 とりあえずもう少しがんばってみます。 ちなみによく４℃で泳動しているプロトコールを見かけますが、 泳動温度はどれくらいの影響があるのでしょうか？ 私の場合は環境上の理由から室温でやっているため、 気温の変化による影響が少し気になっています。 うまくいっていた時期は寒い冬、そして今は暑い夏。 やはり関係あるのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.4530-9 - 2007/07/16 (月) 19:08:43 - カナマイシン 低温室でアクリルアミドゲル作製、の話ですが、 私の場合、必要な時はTEMED添加直前に氷上にて冷やしてます。 室温がそれなりに高くても、重合開始時に溶液を0-4度にしておくことでどうにかなってます。 逆に低温で固まらせようとすると、特にコーム近辺（空気に触れやすい部分）で 重合不十分になり、イマイチなゲルができてしまう経験があります。 なので、冷やして重合開始→ゲル板に注ぎ込み→余力があればそれなりに暖かい部屋で重合、 が現状ではマイベストです。

(無題) 削除/引用 No.4530-8 - 2007/07/15 (日) 21:01:04 - poink Lisaさんコメントありがとうございます。うちの室温は耐えきれない程暑い訳でもないので問題なかろうと思っていたのですが、ゲルの質を落とさない為には気を遣うべきなのですね。 ところでシンさんは解決に至ったのでしょうか。私がこのトピックを見たときは単に泳動関連の問題だろうと感じたのですが、EMSAと泳動とを一度切り離して考えた方が早道かも知れません。ゲル→マーカーや別のサンプルを流してみる、プローブ→作成条件を振ってみる、とか。最終的にはLisaさんのおっしゃるようにバッファーとの相性で改善されるのかも知れませんが。

(無題) 削除/引用 No.4530-7 - 2007/07/15 (日) 16:50:13 - Lisa TBEでやったらスメアになったので、TGEに変えたらうまく行った経験があります。 5×TGE (1L) tris 30.28g Gly 142.7g EDTA(2Na) 3.92g adjust pH8.5 by HCl これを1×で使います。 >poinkさん 夏場クーラーの効いていない実験室くらいだとよろしくないかと。 具体的な温度ではありませんが･･･。 アクリルアミドゲルの重合は温度が高くなるほど進むので、特に硬いゲルを作る時は、低温室で作った方がよいです。 そうでないと、ゲル板にゲルを注いでいるそばから固まってしまい、真直ぐなきれいなゲルが出来ません。 ゆっくり重合させたほうが均一な目のゲルが出来るそうです。

(無題) 削除/引用 No.4530-6 - 2007/07/13 (金) 18:12:08 - シン バッファーを作り直し再度やってみました。 結果は・・・やっぱり変化なしです。 バッファーの調整法は以下のものを単にDWに混ぜただけです。 ・5×TBE（500ml) 　Tris base 27g 　boric acid 13.8g　　 　0.5M EDTA　 10ml pH調整の件ですが頂いたプロトコールに特に記載がなかったためしてません。 一応、確認してみたところpH8.3くらいでした。 なにか悪いところがありましたらご指摘おねがいします。

(無題) 削除/引用 No.4530-5 - 2007/07/11 (水) 20:27:41 - poink ご自身で新調されたバッファーに問題がありそうだということなら、その調整法を記してみたらどうでしょう。pH調整など、自分が問題ないと思っていたやり方に原因が見つかるかもしれません。 ところで私も便乗して質問させていただきますが、昔、「アクリルアミドゲル作成のときに室温が高すぎると良くないから25℃以下で、必要なら低温室で重合した方が良い」と聞いた覚えがあります。具体的に何度くらいで、どう良くないのか、が不明なのですが、どなたか経験ございませんか？

(無題) 削除/引用 No.4530-4 - 2007/07/11 (水) 11:29:13 - シン みなさんありがとうございます。 APSに関しては新しいものでやってみましたが変わりありませんでした。 バッファーは以前に別の人が使っていたのを頂き、 それをがなくなったので自分で新しいものを作りました。 自分も以前にバッファーがあやしいと思い再度作り直してやって見たのですが変化なしでした。 組成は同じはずなのですが、頂いた方がもういないため聞くことが出来ません。 でも、よくよく考えるとバッファーを作り直してからおかしくなったよな気がします。 やはり、なにか自分の作り方がおかしいのでしょか？？ とりあえず、もう一度バッファーを作り直してやってみます。

(無題) 削除/引用 No.4530-3 - 2007/07/11 (水) 01:21:12 - poink バッファー組成がおかしいか、 あるいはゲル作成時のAPSが古くなっていませんか？ 重合が不十分でバンドが間延びすることがあります。 APSは用事調整か、4℃ストックでも２週間以内で新調したほうが良いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.4530-2 - 2007/07/10 (火) 22:07:59 - 〜 ゲルがおかしいのではないでしょうか。 最近バッファーを作り直したりしていませんか？

EMSAのバンドが・・・ 削除/引用 No.4530-1 - 2007/07/10 (火) 18:44:56 - シン EMSAを行っているのですが、ある時期からバンドがスメアになってしまいうまくいきません。 しかも、回数を重ねるごとに状況が悪化している感じです。 試しにタンパク(核抽出液）入れずプローブ（約80bp)だけを流してみたところ、 下半分あたりがスメアになってしまいました。 たぶんこれが原因だど思うのですが、なぜ起こるのかわかりません。 プローブを新しく作り直してもほとんど変わりませんでした。 （プローブはオリゴDNAをアニーリングさせたものを使用しています。） どなたか原因がわかる方がいらっしゃいましたら教えてください。 よろしくお願いします。

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