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切片の組織の大きさについて 削除/引用 No.4510-7 - 2007/07/08 (日) 13:24:36 - mya 厚さについてのアドバイス、ありがとうございます。 使用しているミクロトームは、古いものですが、ちゃんとダイヤルで厚さを調整できるようになっています。 今まで、目盛りはそれほど正確なものではないとは思っていましたが、条件を変えることで、それほど大きくずれてくるというのは、ショックでした。確かに浮かべてみたときの薄片の感じは、切る組織やその他の条件によりずいぶん変わってきていました。 あと、確かに組織の大きさについては標本になった段階でかなり、収縮してしまいますね。 しかし、今回、元の組織の正確な大きさではなく、実験群の中での相対的な大きさがわかればいいので、同じ条件で切片をつくることが大切になってきています。しかし、実際気温などさまざま変化する条件下で、それを行うのが一番難しいと感じています。 Ps.ブロックを冷やしてやることで、ずいぶんと切りやすくなりました。まだゆっくりとミクロトームを動かす必要はあるのですが、しわには大変効果的でした。本当にありがとうございました。

切片の厚さ 削除/引用 No.4510-6 - 2007/07/06 (金) 15:46:02 - 千 たいていのミクロトームは、切片の厚さが設定できるようになっていると思います。 うちのラボで使用しているミクロトームは、ダイヤル式で切片の厚みを設定するようになっています。 多分、あまり新しい型ではないと思いますが、たとえばダイヤルを5μmに設定すると、薄切のたびにブロック固定台が5μm上昇し、5μmの切片が得られる、という訳です。 ただ、そのようにして得られた5μmの切片が、本当に5μmかどうかは別の問題です。というのは、同じ厚さのはずの切片を大量に水に浮かべて見比べたとき、明らかに厚さが違うものが混じるからです。 切片を直接測る方法は、申し訳ないのですが、存じ上げません。 ただ、技師としての経験とカンで切片のよしあしを見分けているだけなのです。 お役に立てなくてすみません。 あと、ひとつ気になったのですが、パラフィンブロックになった時点で、組織は多少収縮しているはずです。切片の厚さを測るのが可能でも、実際の組織の大きさとしては誤差が出てしまうと思うのですが。

早速ありがとうございます 削除/引用 No.4510-5 - 2007/07/06 (金) 11:24:37 - mya いろいろアドバイスありがとうございます。どれも非常に参考になりました。 いただいたアドバイスは早速試してみます。 ・組織の周りのパラフィンが少ない方が良いというのは全く驚きでした。 ・Ａｌ置換は長い方がいいのですね。一応完全脱水のため、焼いたモレキュラーチューブをＡｌのビンに入れてはあるのですが。 ・ブロックを冷やすことはかなり有効そうですね。でも切片の厚さが変わってしまうというのは、頭が痛い問題です。というのは、切片にして組織の大きさを立体的に測定したいと思っているからです。ところで、薄片の厚さはどうやって測られたのでしょうか。　 　もし、よろしければ重ねて教えていただけないでしょうか。

冷してますか？ 削除/引用 No.4510-4 - 2007/07/05 (木) 15:08:34 - 千 切片がしわしわになり、収縮してしまうのは、パラフィンブロックが冷えていないせいだと思います。 ブロックを薄切の直前まで、保冷剤の上などに置いて(適当な保冷剤がなければon iceで。)、よく冷してください。 ただ、パラフィンが膨張していくため、少し厚めに切れますから、10μmの切片を得るならば、8μm程度の設定で切るといいと思います。 室温などにも影響を受けますので、切片の様子を見ながら厚さを調節してみてください。 ただし、冷しすぎると今度はブロックが台から外れてしまうことがあります。 私は、発泡スチロールの箱に氷を詰め、台を下にしてパラフィンブロックを入れ、発泡スチロールの箱のふたは開けたままブロックをストックしておき、薄切してます。室温は25℃くらいです。そうすると程よい冷え加減になります。 もちろん、実験室によって環境は違うと思いますので、「ちょうど良い冷え加減」を見つけるのに少々手間取るかも知れませんが、がんばって見つけてみてください。 包埋過程には多分問題ないと思いますが、自動包埋装置でないなら、100%エタノールはo/nのほうが良いかもしれません。 ちなみに私は70%エタからいきなり100%(×2〜3回、最後にo/n)にしてます。 80,90%は使わなくても出来上がったブロックに問題はありませんよ。 よかったらお試し下さい。参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4510-3 - 2007/07/05 (木) 13:57:33 - 組織 包埋は自動で、他の組織と同じようにやっています。 申し訳ないですが良いプロトコールを知りません。

(無題) 削除/引用 No.4510-2 - 2007/07/05 (木) 13:49:14 - 組織 確かに脳はしわになりやすいですね。 もう試されているかもしれませんが、組織以外の余分なパラフィンを切り落としてやると、しわの入る余地が少なくなります。 あと私は40℃のWater bathに10〜20分浮かべて、切片を拾ったら50℃の伸展板で数時間おいてます。 これである程度はしわを除けていますが、それでも多少は残ることがあります。

パラフィン切片の収縮を防ぐには 削除/引用 No.4510-1 - 2007/07/05 (木) 11:25:15 - mya ８mm角ぐらいの脳の組織を１０μｍで切ってます。 ミクロトームをかなりゆっくりと（１秒間に１/８回転以下）動かさないと、切片が収縮してしまいます。室温２５℃ぐらいまで下げたり、息を吹きかけたりしてみますが、改善されません。ふつうに回すと、組織がよれて、シワができてしまいます。今までもっと小さく一般的な組織しか扱ったことがなかったので、包埋までの過程に問題があるのではといろいろ試行錯誤をしていますがよくわかりません。どなたかアドバイスをいただけないでしょうか。 ちなみに包埋過程は 　PFA固定 　Aｌ　８０→９０(1.5h)→１００×３(30min) 　Ｘｙ×３　　　各30min 　Paraffin×３〜２　1.5ｈ〜一晩（60〜65℃） 　 paraffinはパラヒスト(55〜59℃)の新品を使用しています。 なお伸展はWater Bathにて蒸留水に酢酸を少し添加しています。

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