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(無題) 削除/引用 No.4508-9 - 2007/07/11 (水) 11:13:14 - もち ＞Bostonさん 以前違う細胞では、クリーンベンチとアガロースゲルのゲルを見る機械を使って細胞にUV照射を行っていたのですが、Jurkat細胞ではこの方法のUV照射ではアポトーシスが誘導されなくなってしまったので、論文に従ってStratakinkerに切り替えました。 Jurkat細胞は誘導剤による感受性が強いのですね。研究室にFas抗体があったので、UV照射が上手く行えなかったらFas抗体を使って誘導してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4508-8 - 2007/07/08 (日) 07:01:45 - Boston 私が以前所属していたラボではクリーンベンチの UV ランプ直下 5 cm のところに 30 秒間照射しました (scientific ではありませんが)。Jurkat は様々なアポトーシス誘導刺激 (CH-11, UV, スタウロスポリン) に対して非常に感受性が高い印象を個人的に持っています。４時間後にはカスパーゼ活性化がイムノブロットで観察できます。なので Annexin V や PI による染色は問題ないと思います．

(無題) 削除/引用 No.4508-7 - 2007/07/06 (金) 19:30:22 - もち ＞おおさん、KOさん お二方のご意見、ありがとうございました。 培地がUVを吸収してしまうのですね。初耳でした。 3cm dishを使って違う細胞でUV照射をした時は問題なくアポトーシスが誘導されていたので、培地が原因だとは考えていませんでした。 では培地をのぞいて試してみたいと思います。 ではプロトコルとしては、 �@細胞回収•細胞数計測後、目的の個数分の懸濁液を15mltubeに移して遠心 �A上清を捨て、PBSに懸濁し、6cm dishにまく �BStratalinkerでUV照射 �CUV照射後、細胞を回収•遠心して培地に懸濁 �D6cm dishにまき、4 or 6時間培養 という流れでしょうか？ あと、加えて質問があるのですが、最終的にはこのアポトーシス細胞をCell trackerでラベルしたいのですが、そのラベルはUV照射前と照射後のどちらで行えば良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4508-5 - 2007/07/06 (金) 10:29:34 - KO 自分は付着系でＵＶを照射していましたが、 培地が入っていると、その中のアミノ酸やら核酸で ＵＶが吸収されてしまうので、PBS(-)で2回洗って そのPBS(-)も取り除いてから、Stratalinkerで照射していました。 (5-50J/m2くらいまで) 浮遊ですと、上清を完全に除くというのも難しいので 少量のPBSに懸濁してから、照射するのがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4508-4 - 2007/07/06 (金) 04:43:30 - おお 一度遠心して、少量のバイチかPBSにけんだくしてからUV照射しているのを見かけたことがあります。そうすることにより水によるUVの吸収を最小限に抑えることができます。

(無題) 削除/引用 No.4508-3 - 2007/07/05 (木) 11:32:17 - もち お早いご返事ありがとうございます。 浮遊細胞を使っているので培地の中で照射させています。 アポトーシス細胞と言っても、実験場初期のアポトーシス細胞を多く回収したいので、培養時間を４時間で行っていました。（UV照射50J/平方m、４時間培養というのは論文に載っていた条件です。） でも確かにUV照射自体上手く行っているかの確認のために30時間培養してみた方が良さそうですね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4508-2 - 2007/07/05 (木) 11:13:06 - 名無し 付着細胞とかだと培地を除去した状態でUV 照射するけど浮遊系とかだとそれができないから培地の中で照射するのでしょうかそれだと付着系の条件と同じだと効きが悪いかなあとか思う。それもあるから照射したあといちおう２０時間後くらいまでみたほうがいいかもとかもちょっと思う。

UV照射によるアポトーシス誘導 削除/引用 No.4508-1 - 2007/07/05 (木) 10:58:33 - もち はじめまして。実験系についてお伺いしたい事があります。 今培養細胞にUVをあててアポトーシスを誘導しているのですが、なかなか上手く行きません。 使っている培養細胞はJurkat細胞、培地は血清入りRPMIで、3.3×10の6乗個の細胞を5mlの培地に懸濁した後、6cm dishにまいてUVを照射しています。 UVを照射し4時間培養した後、FACS（AnnexinVとPI）でアポトーシスが誘導されているかどうかを検討しています。（ポジコンは検出できているので試薬は大丈夫です。） UV照射は、STRATAGENEのStratalinker 2400を用いて、50 J/平方メートルになるように行っています。(6cm dish(28平方センチメートル)を使用しているので、140000μJを当てています。） 何かこのプロトコルでの問題点、また誘導のコツなどがあればご教授お願いいたします。

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