形態学の専攻のものです。動物実験でどうしても組換タンパク質を造る必要があり、molecularを人生初めてかじっています。
まずTOPO-TAで目的の配列（X）をクローニングをしまして、これはシークエンスが合っていることを確認できました。ここから発現ベクターのpQE30に乗せ換える為に、TOPOプラスミドからXを制限酵素サイトを付けてPCRで増やして、制限酵素2種類（SphI・HindIII）で切ってpQE30のMCSにLigaseする反応を行いました。大腸菌（DH5α）に形質転換して、コロニーがうまい具合に出てきたので（ここまで泣きそうになるくらい時間がかかりましたが）、コロニーPCRを行いましたらインサートの大きさのバンドが出たので当たりクローンと判定しました。
そこでその大腸菌クローンを定法通り増やして、Qiagenのminiprep spinをかけてDNAを取って、BigDyeでシークエンスを行いました。
この時、
１）Sph配列＋Xの一部、を含むプライマー（TOPOプラスミドからインサートを増やす時に使ったプライマー）
２）pQE30のATG・HISタグより上流のプライマー（フレームシフトがないことを確認するため念のため上流からチェックしようと作ったプライマー）
の2点を使って、pQE30-XプラスミドのBigDye→シークエンスを試みました。
１）の結果はうまく読めませんでした。
２）は全部はうまく読めないのですが、少なくともSphI・HindIIIを含むMCSは読めており、インサートは入っていない配列でした。
つまり、コロニーPCRではインサートを確認できたのに、シークエンスではインサートが入っていない結果となりました。コロニーPCRの結果は奇麗でした。
お伺いしたいのですが、手技に間違いがなければ単一コロニーに空ベクター入りとプラスミド入りが混じっていることになりますが、こういうことはありうるのでしょうか。以前フォーラムで異なるベクターであれば共存しうることを示されている方がいらっしゃいましたが、皆様のご経験からお教えいただけると助かります。
よろしくお願いします。 |
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