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一応 削除/引用 No.4493-4 - 2007/07/05 (木) 12:55:49 - そば 私の書いたコメントは泳動中に分解したのでは無く「泳動前に分解した可能性が高いのではないか」という意味です。 基本的に、組織の保存の仕方やRNA精製の部分を見直すべきかと。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4493-3 - 2007/07/05 (木) 10:48:52 - yamasaki そば様。ありがとうございます。確かに電気泳動中にサンプル中に混ざっている内因性RNaseがRNAをデグらせているような感じですね。RNase inhibitorを混ぜてからやるか、ProKで完全にRNaseを失活させてから電気泳動するのがよいかも知れません。検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4493-2 - 2007/07/02 (月) 11:57:06 - そば 私自身、miRNAのクローニング操作をしたわけではないですが。 既知のmiRNAですらその割合というのはちょっと悪過ぎる気がします。 （参考？論文 PMID:16973894） 得られたRNA断片がrRNAの断片やmRNAの断片ばかりなのであれば、RNAが途中で分解してしまい、small RNA分画にコンタミしてしまっているのではないかと思います。 「組織or細胞からのRNA精製→FlushPAGEで泳動する直前」の部分に注目して操作方法の検討をしてみては如何でしょうか？

miRNAクローニング 削除/引用 No.4493-1 - 2007/06/30 (土) 15:36:29 - yamasaki いつも勉強させていただいています。最近miRNAのクローニング実験を始めたのですが、効率が悪く困っています。方法はまずTRIZOLでRNA抽出後、AmbionのFlush PAGEでmiRNAを抽出し、TAKARAのmiRNA cloningキットを使ってPCRで増幅し、Sse8387Iで切断してコンカテメリゼーションしてからT4 polでBluntingしたのちTAKARAのA付加キットで処理し、PromegaのpGEM-Tに組み込んでいます。青白スクリーニングしているのですが、コロニーはちゃんと出て、一応それなりにコンカテメライズされたインサートが入っているのですが、miRNAが少なすぎるのです。この前はコロニーを１５３６個拾ってシーケンスして、miRNAの候補の長さ（１６−２８に設定しました）の断片が4000個あったうち既存のmiRNAはたった60個くらいで、ほかは多くはribosomal RNAの断片やmRNAの断片でした。どうしたら効率を上げられるのでしょうか？

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