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(無題) 削除/引用 No.4492-7 - 2007/07/11 (水) 18:07:03 - mugimaki 〜さん 詳細な説明ありがとうございました。 色々検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4492-6 - 2007/07/05 (木) 12:36:17 - 〜 >miniprepのものと比べるとmaxiの方がtransfection効率が低いのです。 maxiの方が不純物の持込が多くなるのか、 メーカーの指定した精製だけでは、DNA溶液が濁る場合がありました。 そのため、maxiの後にもPCI処理しています。 その際に、界面上に白い沈殿が見られていますので、 何らかの不純物(たんぱく質?)が除ききれていないようでした。 >PCI フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=50:49:1です。 フェノール：クロロホルム=1:1でもあまり効果は変わらないように見えます。 >収量 収量は100%ではないと思いますが、50%までは落ちないと思います。 50%回収できるのでしたら、カラム2本分を回収すれば、 使い物になる精製度のDNAをカラム1本分回収できる計算になりますね。

(無題) 削除/引用 No.4492-5 - 2007/07/03 (火) 09:32:20 - mugimaki 皆様お忙しいところ、素早い返信本当に ありがとうございます。 大事な情報書くの忘れておりました。ごめんなさい。 Maxi prepで取ったときの純度は260/280で1.8とそんなに低くないと 思います。確認の電気泳動でもスメアをひいたりはしません。スメアを ひいているものは再度エタ沈しています。 〜さん miniprepのものと比べるとmaxiの方がtransfection効率が低いのです。 だから入らないというわけではないです。 〜さんはキット精製後さらにPCI、エタ沈を行っているということでしょうか。 PCIというのはフェノールクロロホルムということでしょうか。 調べてみたのですが、良く分かりませんでした。 フェノクロ、エタ沈で収量がだいぶ減ったりしないでしょうか。 以前エタ沈で収量が半分くらいになってしまったことがありました。 手技的なものが問題なのでしょうか。 aさん なるほど。密度勾配は慣れていないと難しいのですね。 Endotoxin freeを使用しなくても通常の細胞ではtransfection 問題なさそうですね。 ニックという言葉の定義がイマイチ分からないのですが、 DNAに切れ目が入るという認識でいいのでしょうか。 お教え頂けると幸いです。 Kitさん 確かに沢山取りたいので液量を増やしたりしているのでその辺も 影響しているのかもしれませんね。気をつけてみます。

(無題) 削除/引用 No.4492-4 - 2007/07/02 (月) 10:50:58 - Kit カラムを用いた精製の場合には、推奨されている条件をきちんと守らないと純度が落ちますよ。例えば収量を稼ぐ目的で培養の容量を増やしたり、培地をrichなものにしたりするのは避けるべきです。

(無題) 削除/引用 No.4492-3 - 2007/06/30 (土) 16:13:23 - a 私の印象ですが、kitの方が安定して純度の高いものが取れると思います。 密度勾配でも純度の高いものが取れますが、手馴れていなければ、かえって純度を落とすことになります。密度勾配で取る時はニックがあっては困る時のみ行っています（ExoIIIでのdeletion作製とか）。 Endotoxin freeはES細胞の時だけ使っています。 質問ですが、MaxiPrepで取った時の純度はどれ位ですか？

(無題) 削除/引用 No.4492-2 - 2007/06/30 (土) 12:13:48 - 〜 精製が問題と書かれているということは、 同じロットのplasmidを使うと、何回入れても入らないということでしょうか。 アルカリSDS→PEG沈→エタ沈 塩化セシウム 塩化セシウム2回 QIAGEN のMAXIの後にPCI、エタ沈 QIAGEN のMIDIの後にPCI、エタ沈 などで精製して細胞に入れていますが、 今のところ、精製が問題で入らないという経験がありません。 MAXIを使うとうまくいかないということは、 debrisを持ち込んでいるのではないでしょうか。

plasmidの精製に関して 削除/引用 No.4492-1 - 2007/06/30 (土) 09:27:56 - mugimaki いつも興味深く読ませて頂いています。類似の話題が所々にありましたが、 新しくトピックを立てさせて頂きました。 transfectionを行うためのplasmidの精製に関してですが、 皆様はどのようにされているでしょうか。 私の場合、Bio-Radのminiprepで現在は精製しています。 transfectionがうまくいく場合もあれば、いかない場合もあったりして 困っています。maxiprepなど大量にplasmid精製をしたものは、 transfection効率が下がるのでminiprepのカラムやエタ沈で再度 精製しなおしています。 上の先生に相談したところ、塩化セシウム？の遠心で純度を上げることが 出来るが、かなり面倒だという話も聞きました。 Endotoxin freeのplasmid精製キットが販売されておりますが、 こういったものをお使いの方がいらっしゃいましたらご意見頂けると 幸いです。 勿論、transfection効率は、plasmidの精製度のみならず細胞の状態 に関しても大きな影響を与えるので、無視できないとは思いますが、 plasmidの精製に関して色々なアドバイス頂ければ幸いです。

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