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(無題) 削除/引用 No.4488-17 - 2007/07/05 (木) 23:18:49 - TN > aさん やはりgel extractionは行うべきなのですね。 了解しました。 ありがとうございます。 > 〜さん > ベクターの原液を使ってモル比3:1で入れる場合にはその計算になりますが、 > ベクターを10~20倍に薄めると、数十ngで出来る計算になります。 なるほど！ 言われてみれば確かにその通りですね。 私の頭が固かったのか、思いつきませんでした。 ベクターを薄めるというのはとても有効な方法のように思えますので、ぜひ試してみたいと思います。 ありがとうございます。 実はここ1週間ほど、学会のため研究室を離れていましたので、皆さんにお教えいただいた数々の方法をまだ試していないのですが、研究室に復帰し次第やってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4488-16 - 2007/07/05 (木) 12:24:31 - 〜 >pGEMのプロトコルによると、17kbくらいの断片の場合、ライゲーション1回につき大体800〜2700ngくらい必要とのことです。 ベクターの原液を使ってモル比3:1で入れる場合にはその計算になりますが、 ベクターを10~20倍に薄めると、数十ngで出来る計算になります。 >実際400ngくらいの断片を使ってライゲーションを行った時にはうまくいきませんでした。 ゲル抽出がうまくいっていないようですので、 夾雑物も多く回収してしまっているのではないでしょうか。 PCRやライゲーションでは、DNAを多く持ち込むよりも、 薄めた方が収量(やコロニー数)がよくなる場合があります。

(無題) 削除/引用 No.4488-15 - 2007/07/03 (火) 14:25:33 - a あべちゃん様 ご指摘の通り、ライブラリー作製などでゲルを切り出しても、異なったサイズのものもクローニングされることが良くあります。 deletionライブラリーを作製してるときには良くわかります。大量のDNAを電気泳動していますので、幾らかは小さなサイズのものが混じってくるからではないでしょうか？しかし、目的サイズ付近のバンドが最も多く取れます。 ライブラリーの場合、漏れたサンプルがゲルの表面を流れないよう注意しています。５分くらい泳動したところで、ゲルを揺らして表面を走っているサンプルを希釈しています。

PCR Wizard SVが気に入ってます 削除/引用 No.4488-14 - 2007/07/02 (月) 20:04:59 - あべちゃん > ねこたろうさんは書きました : > aさんの言われるように電気泳動で確認できないようなフラグメントもPCR産物には混じっているので結局直接ライゲーションは効率が良くないことも多いですね。 確かに、シングルバンドなのに違う物がとれてくるような場合は、目的断片の配列自体または目的断片の末端付近が何かしら嫌われてるのでしょう。でも、そういった場合、切り出しても同じかなぁと思います。例えばライブラリーを作るときに、電気泳動で４kbの所を切り出しても、色々なサイズの断片がとれてくるのと同じように、目的外の断片が取れると私は思うのです。 　このようなとき、ねこたろうさんやaさんは、どの様な工夫をされるんでしょうか？後学の為に教えてもらってもいいでしょうか？ > ゲル回収用のキットはいろいろなメーカーから出ていますがカタログ通りの高効率で回収できるキットはあるのでしょうか？ プローブ用の断片を作成するなどで、私はプロメガのPCR Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kitを使っています。理由は、ゲルを溶解させる試薬がキアゲンでは３倍量であるところ、１倍量で済むのと、商品名にもありますがPCR産物や制限酵素後の反応液からDNAを精製することにも使えるからです。 収量は0.5-4kb位で、問題に感じたことはないですが、今回のトピックにあるような大きなサイズは試したことがないです。

(無題) 削除/引用 No.4488-13 - 2007/07/02 (月) 18:45:18 - ねこたろう aさんの言われるように電気泳動で確認できないようなフラグメントもPCR産物には混じっているので結局直接ライゲーションは効率が良くないことも多いですね。 ゲル回収用のキットはいろいろなメーカーから出ていますがカタログ通りの高効率で回収できるキットはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4488-12 - 2007/07/02 (月) 18:27:07 - a 以前私もPCR産物をダイレクトにligationしましたが、目的のクローンが効率よく取れなかったのでやめました（電気泳動でシングルバンドに見えていても）。 やはり、ゲル回収はした方が良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4488-10 - 2007/07/01 (日) 12:01:13 - TN > 〜さん pGEMのプロトコルによると、17kbくらいの断片の場合、ライゲーション1回につき大体800〜2700ngくらい必要とのことです。 実際400ngくらいの断片を使ってライゲーションを行った時にはうまくいきませんでした。 > あべちゃんさん TOPOも今手元にありますので、pGEMがダメだったらやってみようと思っています。 PCR反応液を直接（といってもEt沈後ですが）ライゲーションに使うことも出来るんですね。 PCR反応液にはいろいろな物質（酵素とか）が混在しているので、ligaseの活性を阻害しうるんじゃないかとかいろいろ考えてしまって、まだやってみていませんでした。 でもこれが可能なら一番手っ取り早いですね。 ご助言ありがとうございます。

ゲル切り出し自体を 削除/引用 No.4488-9 - 2007/06/30 (土) 21:22:46 - あべちゃん DNA断片10kb程度の物しかやったこと無いですが、それを前提で、 僕はゲル切り出し自体を極力減らしています。 今回の場合なら、 LA-Taq PCR product をそのままinvitrogen pCR-TOPO cloningでクローニングベクターにライゲーション。その後、形質転換。 TOPO cloning kitは高価ですが、まず、指定量の1/4スケールで８割位はポジティブクローンを得られます。 ベクター作りは１６時間待ち、とかがあるので、極力やり直しを避ける事を考えれば、高くない買い物だと思います。 キットをどうしても買えない環境なら、 PCR反応液を制限酵素Dpn1で処理して、鋳型プラスミドを消化する。 次に、エタ沈してTEに再溶解。 その後、T-vector (?)へ、ライゲーション。 TOPO-cloning kitに出会うまではこの方法でやってました。このときは１６個ほどコロニーをつついてました。

(無題) 削除/引用 No.4488-8 - 2007/06/30 (土) 20:57:50 - 〜 すいません。 ゲルから切り出したDNA断片はどれだけ必要だと考えているのでしょうか。 私は0.01ngもあれば十分だと思っているのですが。

アドバイスありがとうございます。 削除/引用 No.4488-7 - 2007/06/30 (土) 18:30:41 - TN > カナマイシンさん 同じkitを用いて、約11kbの断片は（回収量などは測っていませんが）問題なく回収出来ました。 一方で17kbくらいの断片ではうまくいかないので、困っています。 やはり長い断片だと回収量が下がるものなのでしょうか？ 長い断片をextractする際にbufferにDWを入れるのはやっています。 多分プロトコルの見落としはないと思うのですが…。 ご紹介いただいた別のkitの方もためしてみたいと思います。 ご助言ありがとうございます。 > 〜さん すみません、スタートのバンドの量および収率は測っていないので分かりません。 普通50%くらい回収出来たら大成功と考えていいのでしょうか？ パラフィルムを使った方法は思いつきませんでした。 押しつぶして出てきた液を直接ligationに使うことも出来そうですが、（それだと多分1回では十分な量のDNAが確保出来ないと思うので）その液を集めてエタ沈して使うということも出来ますよね？ やってみたいと思います。 ご助言ありがとうございます。 > aさん ベクターはプロメガのpGEM T easyで、コンピテントセルはタカラのE. coli DH5aです。 ご紹介いただいた方法ですと時間もあまり掛からないようで実践的ですね。 こちらも試させていただきます。 ご助言ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4488-6 - 2007/06/30 (土) 16:05:33 - 〜 >げるちゅう さん ルーチンに行われたところを見たことがありませんが、 院生時代の隣のラボの先輩は複数回この方法でクローニングしていました。

(無題) 削除/引用 No.4488-5 - 2007/06/30 (土) 15:18:16 - a ベクターとコンピテントセルは何をお使いですか？ kit以外の方法ですが、参考になれば 低融点アガロースで泳動、バンド切り出し ↓ 65℃でアガロースを溶かして、40℃に下げます ↓ βアガラーゼを0.5μl添加 ↓（ゲルが再度固まらないよう注意） そのまま40℃で30minインキュベート ↓ そのままライゲーションへ（TAクローニングなら2〜3μl程度使用しています） 基本的に回収したバンドはロスがありません。バンドの部分のみを回収していますので、最終的には10μl程度になります。

よこからしつれいします 削除/引用 No.4488-4 - 2007/06/30 (土) 14:06:28 - げるちゅう ＞切り出したバンドをパラフィルムで押しつぶして、 出てきた液でライゲーションすれば取れてきませんか？ この方法はルーチンで使われていますか？小PCR断片のサブクローニング程度ならこれで十分うまく行っているということであれば、試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4488-3 - 2007/06/30 (土) 12:27:18 - 〜 QIAEXIIで、16kbを収率50%位で回収できていました。 スタートのバンドの量は何ngで、収率は何％だと考えているのでしょうか。 >DNA回収量を上げるための方法 回収量を上げるための方法ではなくて、操作上の問題点を探すほうが先ではないでしょうか？ ただ、クローニングであれば、回収率を上げる必要は無いのでは？ 0.1ngもライゲーションしたら、十分すぎるコロニーが得られると思いますが。 切り出したバンドをパラフィルムで押しつぶして、 出てきた液でライゲーションすれば取れてきませんか？

(無題) 削除/引用 No.4488-2 - 2007/06/29 (金) 20:10:05 - カナマイシン 同じキットにて 20 kbの断片を精製しています。 制限酵素処理後のベクターですが、いい感じで精製できています。 回収率等ははかってないですが・・・ 同じキットでもっと短い断片の精製はされたことがありますか？ あと、プロトコールはよく読まれていると思いますが、 長い断片だとバッファーにDWを追加する点などもだいじょうぶでしょうか？ 当方、以前はBio-Rad社の Freeze'n Squeeze スピンカラムを使用していました。 とても簡単なのでいいんですが、 ・切り出しの際にバンド以外のアガロース部分が混入すると純度が落ちると書いてあるが、 　UVを当てながらこの作業をやるのがイヤだった。 ・Elution Volume が調節できない 　（そのあとエタ沈すればいいが、その際のロスがイヤだった）。 という２点を理由にQIAEX II に切り替えています。 個人的には収率に大差は感じませんでしたが、試されてみては？ 特にバンドの可視化法がUVでなかったりするのであればオススメします。

gel extractionのコツ 削除/引用 No.4488-1 - 2007/06/29 (金) 18:33:35 - TN 現在約17kb〜20kbくらいのDNA断片をLA PCRで増やしてベクターに挿入する実験を行っています。 PCRは成功したので、QIAGENのQIAEX II gel extraction kitを使ってPCR産物を回収する作業に入っているのですが、回収出来るDNAの量があまりにも少なくて困っています。 50ulの系でLA PCRを行って、そのPCR反応液をすべて流してgel extractionをしても、回収されるDNA量は0〜50ng程度です。 もちろん、プロトコルにあるように、gel extractionに使用するバッファーのpHには気を使っていますし、その他プロトコルに記載の注意事項にはすべて気を付けているつもりなのですが、改善は見られませんでした。 どなたか、DNA回収量を上げるための方法などをご存知の方はいらっしゃいませんか？ または、上記のgel extraction kit以外を用いてpurified DNAを得る（しかも高いDNA回収量が期待出来る）方法をご存知の方はいらっしゃいませんか？ よろしくお願い致します。

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