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とりあえず免疫してみます 削除/引用 No.4486-10 - 2007/07/12 (木) 09:56:54 - 免疫したい 出題者です。たくさんのアドバイスありがとうございました。 説明がつたなかったのですが、バキュロウイルスを使ってタンパク発現させたHis-Tagタンパク質です。変性させないとNiカラムにまったく結合しなかったので、Hisがマスクされてしまったのだろうと思い、Guanidineで変性させた次第です。（Niカラムに結合しない時にも、この掲示板でいろいろアドバイスをいただきました。その節もお世話になりました） ちなみに、C末にHisがついているのですが、このタンパク質のN側が私の見たい機能に重要だと考えているので、N末にHisをつけることはしたくないのです。Niカラムでの精製にこだわらずに、非変性で精製を試みることも考慮すべきだとは思うのですが、せっかくタグをつけたので、出来れば生かしたいというのがあって変性条件で精製しました。そんなわけで、変性条件で精製して免疫したいと思った次第です。 良い抗体（自分が使う目的に合う抗体）が出来るかどうかは、試してみないとわからないという感じですし、不溶化したまま免疫というのもアリのようなので、とりあえずそのままで免疫してみようと思います。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4486-9 - 2007/07/07 (土) 12:45:49 - A 訳があってTCA沈殿させた蛋白質をアセトンで洗って除酸したものを8M ureaに溶かし、アジュバンドと１：１で混ぜてウサギに免疫しました。エマルジョン出来るのがちょっと時間かかったくらいで特にトラブル無く、非常によい抗体ができました。

(無題) 削除/引用 No.4486-8 - 2007/07/07 (土) 10:42:22 - page >yamasakiさん 可能です。 トリプシンでの消化は変成させることを前提としたプロトコルが当たり前 ですが多いです。限定分解ですので。 まず、6 M Guanidine HClや8 M Ureaで変成させ、段階的に希釈し、 いずれのケースでも1 M以下まで落ちれば後は切ってくれると思います。 私はプロメガの商品をこのんで使用していました。PDFファイルにプロトコル があったと思います。

(無題) 削除/引用 No.4486-7 - 2007/07/06 (金) 22:46:34 - A 私も同僚が不溶性の蛋白質を抗原として抗体を作ったのを見たことが あります。目的はＥＬＩＳＡに使うためでしたがあまり良い抗体が 出来ませんでした。理由は未変性蛋白質の認識を目的としていた からと想像しています。ですからもし使用目的が免疫染色（違う場合も ありますが）やＷＢならばどちらも変性蛋白質を認識する抗体が 必要なわけですから変性蛋白質を抗原として使っても良い抗体ができる 可能性はあります。 >[Re:6] yamasakiさんは書きました : > 便乗で素人質問させていただきます。たとえばトリプシンとかで >限定分解してsolublityをあげてから免疫なんてできないのでしょうか？ >ペチド抗原のカクテルみたいな感じになると思うのですが・・・。 >不溶性なのでトリプシンも反応しないのでしょうか？ 一部は分解されるかもしれませんが、基本的にトリプシンの酵素反応は 加水分解反応ですから分解されるのは水液中の蛋白質のはずです。 ですからあまり効果ないと想像されます。

(無題) 削除/引用 No.4486-6 - 2007/07/05 (木) 10:44:21 - yamasaki 便乗で素人質問させていただきます。たとえばトリプシンとかで限定分解してsolublityをあげてから免疫なんてできないのでしょうか？ペプチド抗原のカクテルみたいな感じになると思うのですが・・・。不溶性なのでトリプシンも反応しないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4486-5 - 2007/07/03 (火) 11:05:10 - おお 不溶化の状態でも免疫して抗体を得るというのはよくやる手だと思います。 細かいことになれば良しあしはあるかもしれませんが、打たなければ抗体はできませんから。極端な例では、封入体をそのまま免疫というのも珍しくないと思います。 もし溶液状でやりたければ抗原を半分ぐらいの長さにしぼったりして、６M Guanidineを使わなくても可溶化画分に来るようにするとかのほうが早いと思います。ちなみに６M Guanidineを使わないと(非変性条件で)どれぐらいの収量でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4486-4 - 2007/07/02 (月) 21:05:48 - a 私も不溶化状態の蛋白を免疫したことがあります。 ただ、エマルジョンがいまいちだったので、良い抗体はできませんでした。 そのまま免疫すると同時に、もう一度refoldingの条件の検討を同時に行えば良いのでは。

(無題) 削除/引用 No.4486-3 - 2007/07/02 (月) 19:51:11 - R よく不溶化した状態のままエマルジョンを作って免疫していますが、抗体は問題なくできます。 可溶化した状態の方が、免疫沈降に使えるいい抗体ができる可能性が高いらしいですが、経験上、不溶化タンパクでも大丈夫なこともあります。 確か６Ｍ尿素の存在下で免疫したとかいう話が過去のトピックにあったような気がしますが、見つけられませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4486-2 - 2007/07/01 (日) 18:16:19 - 名無し やったことないけどSDS-PAGEのCBBゲルのバンド切り出してつぶして注射する事もあるというのはいろいろな人から聞いたことがあるから溶けてなくても免疫は出来ると思う。というか見た目溶けてなくてもミクロの視点で見れば注射した局所で少しは溶け出すだろうし要は抗原として認識されればいいのだからあまり気にしなくていいと思う。

不溶化したタンパク質の免疫 削除/引用 No.4486-1 - 2007/06/29 (金) 16:31:51 - 免疫したい いつも参考にさせてもらっています。 リコンビナントタンパク質を免疫に使いたいと思っています。 ６M Guanidineの変性条件で精製して、透析で段階的にGuanidineを抜き、PBSに持ってきたところでタンパク質が析出してしまいました。免疫する場合は可溶性でないとまずいような気がしますが、実際のところ、どうなんでしょうか？免疫したら体内で分解されてちゃんと抗体ができるもんなんでしょうか？ みなさんは、こういう場合（不溶化しちゃった場合）どうされていますか？ アドバイスをいただけると助かります。

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