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(無題) 削除/引用 No.4478-17 - 2007/07/03 (火) 17:25:02 - ネモ インビトロジェンの場合、50mer以上のオリゴはHPLC精製できないらしいです。 しかもPAGEは海外で。。。 納期2週間以上らしいです。 全般的には結構融通利いてやってくれるのでインビトロジェン社は重宝してるんですが。。

(無題) 削除/引用 No.4478-16 - 2007/07/03 (火) 17:13:54 - 奴隷 PAGEから切り出すことによる完全長オリゴの精製は自前でも簡単にできますよ。１本だけなら大した値段でもないので外注してしまうのでしょうけど。 http://www.jncasr.ac.in/uday/Protocols/PAGE_purification_of_Oligos.pdf

(無題) 削除/引用 No.4478-15 - 2007/07/03 (火) 17:07:11 - Ｔ 50 mer 程度ならカートリッジ精製でもまず問題はないでしょうが、HPLC や PAGE に比べると純度は落ちるので、その点には留意して使った方がいいでしょう。 > カートリッジ精製の原理上、長鎖オリゴDNAを精製する場合、完全長のものとN-XオリゴDNAの分離能が落ちるため50mer 以上の長鎖にはあまりお勧めできません。（ロングオリゴDNAはPAGE精製をお勧めします。） http://www.genosys.jp/products/oligo/oligo_02.html

プライマーの質 削除/引用 No.4478-14 - 2007/07/03 (火) 16:55:42 - ネモ みなさん、本当にありがとうございます。 大変参考になります。 現在、インビトロジェンにカートリッジ精製で頼みなおしているところです。 しかし、プライマー合成を受注している会社もたくさんありますが、 50mer前後の修飾ないプライマーで品質、スピードという点で考えた場合、 お勧めな会社ってございますか？？

(無題) 削除/引用 No.4478-13 - 2007/07/03 (火) 09:51:32 - う〜んと >[Re:12] ネモさんは書きました : > 相補部がテンプレートにアニーリングし、 > 目的の遺伝子が増幅されつつ、 > 付加部もテンプレート側から伸長します。 > そのときにアニーリングしてない部分（付加部）は、 > 非常に不安定のためエキソヌクレアーゼ活性によって、 > 脱落するケースが良く見られる。 > というのを聞いたことがございます。 3'末端のPCR酵素によると思われる修正なら経験がありますが、5'末端は経験がないです。 5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を持ってるPCR酵素ってありましたっけ？ ちょっと記憶が不確かですが．．． proof-reading酵素は3'→5'エキソだった気がします。 ゲノムDNAに対象バクテリア由来のヌクレアーゼが残ってる可能性はなくはないですが、まぁ合成DNAでしょうね。 オリゴハウスは選んだほうがいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.4478-12 - 2007/06/30 (土) 00:52:32 - ネモ 相補部がテンプレートにアニーリングし、 目的の遺伝子が増幅されつつ、 付加部もテンプレート側から伸長します。 そのときにアニーリングしてない部分（付加部）は、 非常に不安定のためエキソヌクレアーゼ活性によって、 脱落するケースが良く見られる。 というのを聞いたことがございます。 プライマーは55merで脱塩精製です。 計算したら99％合成がうまくいったとしても、 最終産物は60％くらいになりました。 脱塩グレードなのでもっと悪いことは確実ですね。 明らかにプライマーのせいですね。。。

(無題) 削除/引用 No.4478-11 - 2007/06/29 (金) 16:37:22 - 奴隷 オリゴヌクレオチド合成の１ヌクレオチド毎の平均カップリング効率は通常99〜99.5%と言われています。仮に99%であったとすると、20ntのオリゴヌクレオチドで完全長の産物は約80%、80ntで完全長の産物は約45%です。すなわち、それぞれ20%、55%は変異や脱落を持った分子ということです。

(無題) 削除/引用 No.4478-10 - 2007/06/29 (金) 16:17:42 - 奴隷 問題のあったプライマーの長さと精製度（外注ならゲル濾過、OPC精製、HPLC精製、PAGEからの切り出しのいずれかだと思います）を教えてください。 また、エキソヌクレアーゼ活性でオリゴヌクレオチドの途中が抜けるというのは考えにくいと思いますが、どういう反応を想定されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4478-9 - 2007/06/29 (金) 14:05:52 - ネモ 優れたフィデリティーの酵素によるエキソヌクレアーゼ活性によって、 相補部ではなくて付加部に変異もしくは脱落が確認されるケースがあると、 聞いたことがあったのですが、 これはまちがいですかね。。。 バクテリアゲノムなのでPCRそのものは、 非常に簡単に増幅されます。

(無題) 削除/引用 No.4478-8 - 2007/06/29 (金) 13:28:01 - う〜んと ゲノムサイズが大きいとPCRクローニングで苦労することがあるのと、タグ等の付加配列があるとPCR条件を最適化するところで妥協が必要なので、一般論としていったんクローニングするほうがいいとご理解ください。 たぶんバクテリアのゲノムなので、PCRも簡単なんでしょうね。 付加配列にのみ設計外の配列が見られるのなら合成DNAの純度の問題でしょうね。 >フィデリティーの高い酵素によって増幅すると、 とあったので、3'末端側に配列の変化があるのかと思いました。 経験的にはEx-TaqとかLA-Taqとか増幅効率の良い酵素を使った場合に多いですけどね。

(無題) 削除/引用 No.4478-7 - 2007/06/28 (木) 21:14:46 - mimi HPLCやPAGE精製後、MSで確認してもらうのが安心です。 時間を無駄にしないためにも。 あるいは、普通に既製のHis-Tag付加ベクターにクローニングするのが 結局は早いんではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4478-6 - 2007/06/28 (木) 20:31:33 - 名無し Tさんのおっしゃるとおりオリゴの問題だと思います。 こういうときは、 「どのクローンを採ってもプライマーに相当する配列に ミューテーションが入っていた」 と言えば、無償で再合成してくれると思います。

(無題) 削除/引用 No.4478-5 - 2007/06/28 (木) 20:27:59 - 奴隷 Ｔさんがご指摘のようにプライマーの品質の問題であると思われます。 校正活性を備えた高フィデリティーのPCR酵素は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持っているのであって、オリゴの途中が抜けたりすることはありません。 オリゴヌクレオチド合成のケミストリーは各ステップ必然的に100％ではあり得ず、長くなればなるほど不完全長の産物の割合が増えます。

(無題) 削除/引用 No.4478-4 - 2007/06/28 (木) 19:51:16 - Ｔ オリゴの品質に問題があるのだと思います。 長めのプライマーを作る場合は、信頼できる会社の PAGE 精製オリゴを使いましょう。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4478-3 - 2007/06/28 (木) 18:56:00 - ネモ コメントありがとうございます。 現在、ゲノムから直接PCRしまして、 そのシーケンス確認を行ったところ、 目的遺伝子内において変異はみられませんでした。 しかし、末端のヒスタグ等におきまして、 変異が挿入されてしまうという状態です。 ベクターにクローニングしたテンプレートに対して PCR条件を検討することで、 この新たに導入する部位の変異が入る確率を 低下させることが可能なのでしょうか？ また、条件検討というのは、具体的に何を行ったらよろしいでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4478-2 - 2007/06/28 (木) 17:07:23 - う〜んと 何という生物のゲノムか知りませんが、ゲノムDNAを鋳型にしていきなりタグ等をつけようとしているのなら、いったん正しい配列のクローンを取得してそれを鋳型にするほうが良いと思います。 変異PCRでのサイクル数等の条件をコントロールしやすいので。 酵素は個人的にはKOD系統よりはPfuのほうが好きです。 Prime...は使ったことがないです。

PCRによるヒスタグの導入条件について 削除/引用 No.4478-1 - 2007/06/28 (木) 16:50:44 - ネモ ゲノム中の目的遺伝子のC末端側に、 ６XHisTagと制限酵素サイトをPCRによって導入し、 TOPOベクターにサブクローニングしようとしています。 しかし、KOD plusやPRIME STARなど、 フィデリティーの高い酵素によって増幅すると、 エキソヌクレアーゼ活性によって、 その導入するタグ部と制限酵素サイトに変異および脱落が確認されます。 かなりの個数のクローンをシーケンス確認したのですが、 さまざまな変異が確認されます。 何かいい方法をご存じの方、おりませんでしょうか。 よろしくおねがいいたします。

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