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(無題) 削除/引用 No.4473-5 - 2007/06/30 (土) 16:58:28 - a 私はdsオリゴのクローニングをしていますが、そういったことは一度もありませんでした。使用したオリゴはmiRNAをコードしているので2次構造も形成しやすいと思いますが。トータルで15種類やりましたが、全てシングルバンドになりましたよ。 オリゴは特別精製していません。invitrogenで合成したものをしよう。アニーリングさせるときは沸騰したお湯につけて、あとはゆっくり冷ますだけです。kitに含まれるバッファーを使ったので、塩濃度はわかりません。

(無題) 削除/引用 No.4473-4 - 2007/06/29 (金) 01:23:00 - DAG 銅鑼さん、サイコさん、ありがとうございます。 >銅鑼 さん 同じような条件で成功されているのですね。こちらは切り出せるようなメジャーバンドも出ませんでした・・ 二次構造をとるような配列は（Genetixでざっと見ただけですが）ないようです。 >サイコ さん Mgを入れてみましたが残念ながら変わらずスメアなバンドのままでした。 なんだか、オリゴ自体に問題があるような気がしてきました。一番安い簡単な方法で精製されたものを注文して使っているので・・

(無題) 削除/引用 No.4473-3 - 2007/06/28 (木) 14:12:52 - サイコ 10 mM Mgをいれてみましょう。

(無題) 削除/引用 No.4473-2 - 2007/06/28 (木) 13:03:26 - 銅鑼 アニーリングさせた50bpをPAGEで流したことがありますが、綺麗に流れました。アニーリングの条件もほぼ同じです。 オリゴの配列的に他の構造もとったりしそうではないですか？ 予想位置にメジャーにバンドが出るならばゲルから回収も手ですが、そうでもなさそうですね。

オリゴDNAのアニーリング 削除/引用 No.4473-1 - 2007/06/27 (水) 22:33:31 - DAG はじめまして。よろしくお願いします。 DIGゲルシフトキットいうものを使ってゲルシフトアッセイを試みようとしています。 結合すると思われる配列周辺を含むオリゴDNAを用いてアッセイを行おうと考えています。長さは50bです。 実際にゲルシフトを行う前に、きちんとオリゴがアニーリングしているかを確認するため、アニーリング操作後のオリゴをTBEアクリルアミドゲルで泳動してみました。予想としては50bpの所にバンドが現れると思っていたのですが、結果は全面スメア（所々ラダーになっているようにも見えます）になってしまいました。 これは普通のことなのでしょうか？このままプロービングしてゲルシフトを行うべきか、シャープなバンドが現れる条件を検討すべきか・・。経験のある方の御意見をお聞きしたいです。 アニーリング条件は以下の通りです。 1.95℃のヒートブロックで10分間保温。 2-1.ヒートブロックのスイッチを切り、室温になるまで放置 または 2-2.取り出して室温放置 バッファーはTEだけのものと、TE+0.1MNaClのもので試しましたが、結果は変わりませんでした。

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