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(無題) 削除/引用 No.4468-8 - 2007/06/28 (木) 14:07:19 - むう 私はstratageneのmutazyme2を使っておりました。 売り文句としては変異の偏りがないことと鋳型の量を振るだけで 変異導入率をコントロールできるということでした。 話は変わりますが、最適な変異導入率とはどのくらいと考えておりますか？ この手の実験であれば多少のnonsense mutationは当然入ってきますが、 ハイスループットなセレクションのシステムが確立されていれば無視できるのではと思います。 特に、nonsense mutationを恐れて変異導入率を低く設定するとそのライブラリ中には 変異が１ヶも入っていないものが多数を占めたりして、ライブラリのバリエーションが 低くなるという報告を読んだことがあります。 PEDEL　http://guinevere.otago.ac.nz/aef/STATS/index.html というmutagenesisに関するdatabaseのreferenceを参考にしてみて下さい。 他にも私はMutagenesis Assistant Program(MAP)というdatabaseを参考にしてました。 PMID: 16325201です。こちらも良かったら読んでみて下さい。 長々と失礼しました。頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.4468-7 - 2007/06/27 (水) 18:59:52 - ima そうですか。ありがとうございます。 バッファーの組成ばかり変えていたので鋳型の量を振るというのは考えませんでした。早速試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4468-6 - 2007/06/27 (水) 16:38:05 - mut いや、そういう意味ではありません。 imaさんがerror-prone PCRとして最初に試みられた条件では変異率が高すぎたということでしたよね。そのバッファー条件をそのまま使って、鋳型を例えば５倍ずつ増やした系列を作ってPCRを行い、そのうちから適当な変異率のものを選ばれてはどうかとお勧めしたのです。

(無題) 削除/引用 No.4468-5 - 2007/06/27 (水) 15:48:49 - ima mutさんありがとうございます。 fidelityの低いtaq polymerase等を用いれば、鋳型DNAの量を減らしていけば、特にバッファーに手を加えなくても、エラーはある程度起こるものなんでしょうか？基本的な質問で申し訳ございません。最近この実験を始めたもので。

(無題) 削除/引用 No.4468-4 - 2007/06/27 (水) 15:19:32 - mut バッファーの条件を振るのは最後の手段に取っておいたらどうですか？こうすると変異率が高くなるといった条件はいろいろとあるでしょうが、それを振ることで変異率を定量的に調節するのは難しいでしょう。 ＰＣＲはサイクルの最後にはほとんど基質とプライマーが枯渇して産物の量はプラトーに達して終わっています。したがって、鋳型量が多ければ平均複製回数は少なく、結果として変異率は少なくなります。

(無題) 削除/引用 No.4468-3 - 2007/06/27 (水) 14:39:13 - ima mutさんありがとうございます。 鋳型が多いほど、エラーの割合は減ると考えていいんでしょうか？エラープローンは一般的にマンガンイオンとか各dNTPの濃度とかをふったりもすると思うんですが、それの検討についてはどのように行ったのでしょうか？エラープローンを行っている論文を読むと、どれも条件が異なるので、何から取り掛かっていいか分からないもので。

(無題) 削除/引用 No.4468-2 - 2007/06/27 (水) 13:20:29 - mut 酵素とバッファーの条件を一定にすれば、残るはcycleが実質的にどれだけ回るかだけですので、例えば25サイクルに固定して加える鋳型DNAの量を振っています。

エラープローンＰＣＲについて 削除/引用 No.4468-1 - 2007/06/27 (水) 13:04:12 - ima 現在エラープローンPCRにてランダムな変異導入の実験を行っております。フルシークエンスをしたところエラーは入っているのですがエラーの数が多く途中で終始コドンに変わってしまっていたり、あるいは欠失して（そもそも欠失が起きるわけがないと思っていたのですが）フレームシフトしてしまい、酵素が発現しない場合が多く困っています。エラープローンPCRは最適な条件を見つけるのにかなりの時間を費やす事は重々承知なのですが、実際にエラープローンPCRを行った方がいらっしゃれば、どういう感じで最適の条件を見つけたのかを教えてもらいたいです。

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