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私なら．．． 削除/引用 No.4467-4 - 2007/06/27 (水) 17:09:47 - MX TAクローニングしてからのシーケンス決定だと複数クローン読む必要もあるし，一日余分な手間と時間がかかると考え，私ならPCRに使った2本のプライマーそれぞれでPCRプロダクトをダイレクトシーケンスしますね．シーケンス反応は2個のみ．これで通常のPCRプロダクトなら端から端まで全長カバーできるでしょう．片方のみでも実用上は問題ないでしょうが，プライマー端は読めません．これであまりにも波形が汚ければたまたま同じサイズに見えているが異なる複数の配列が増幅されているという可能性があるのでPCRの条件を変える（アニーリング温度を上げる）か，PCRプライマーを設計し直した方がいいでしょう．この段階で複数クローンあるからといってTAクローニングをするのは何が目的なのかわからなくなっています．目的のバンドのみが増幅されていたらダイレクトシーケンスで読めるはずですから．

(無題) 削除/引用 No.4467-3 - 2007/06/27 (水) 13:01:44 - mugimaki 私の場合はTA cloningしてsequenceしています。 PCRでは類似の配列を認識し増幅していることもありますので きっちりとPCR Productの配列を決められるようにTA Cloning しています。 参考まで

(無題) 削除/引用 No.4467-2 - 2007/06/27 (水) 10:32:25 - 奴隷 １）ダイレクトシークエンスで配列を決定する。 ２）制限酵素で切断して予想通りの切断パターンを確認する。

目的のバンドだと証明する実験 削除/引用 No.4467-1 - 2007/06/27 (水) 10:28:25 - みみ PCRで出たバンドがニセバンドでなく 目的のバンドであると証明するような実験方法はありますか？

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