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スミマセン・・・ 削除/引用 No.4463-19 - 2007/07/05 (木) 22:02:07 - リアル レスが滞っていました。 皆さんの意見をとりいれつつその後実験を続けた結果、どうやらNTCの増幅に関してはコンタミではないかとの結論に至りつつあります。何回かの実験の結果、３％ゲルでは非特異的な産物と目的産物に差が見られません。アガロースゲルレベルでは同じ長さのモノを増やしているという結論です。またダイマーに関しては異なるTm値（目的産物より低い）と異なる長さのバンドを確認しました。 そもそも何か違う長さの配列を増幅していると考えた根拠は目的産物と異なるTm値（1〜２℃程度高い）であることからでした。ただ、その差を無視すればコンタミで間違いないと考えています。（少し強引ですが。） 目的産物の解離曲線がいびつな曲線になるという問題に関しても実験を重ねるうちにピークは一つにはなりました。以前のピークに比べるとシャープではありませんが。以下のように蛍光の量(検出力)が変化しているせいもあるのかもしれません。 ＞酵素活性の高いものほどdimerが出やすい傾向にあるような気がします。 蛍光量の違いに関しては a さんのおっしゃるとおりなのかもしれません。実験がうまくいっていたときの試薬は劣化していていたのかもしれません。(私が実験を始めるまでコンスタントに使用していた人はいなかったので) LOTに関しては昔使っていたモノの情報がないので確かめることができないのですが。。 今後はさらに何度が実験を重ねてNTCの増幅が出ない状況を再現できたらもう一度実験系の最適化を行って対処しようと考えています。あとは機械のメンテナンスも考えています。バックグラウンドの補正や蛍光のキャリブレーションなどです。 さらに質問で申し訳ないのですが機械のメンテナンスは実際どの位の頻度で行っていますか？説明書どおりだと毎週のメンテから毎月、半年などかなり頻繁にあります。蛍光のキャリブレーションに関しても半年に一回という頻度どそうですが、業者に尋ねたところキャリブレーションのキットは大学や研究所ではほとんどでないとのことです。なので実際皆さんがどの程度メンテナンスを実行しているのか教えていただけませんか？

(無題) 削除/引用 No.4463-18 - 2007/07/05 (木) 12:06:44 - 横槍 大変貴重な情報ありがとうございます。 私もストイックに最適化しても、その後ガンガンPCRをかけていると、突如ネガコンから現れるバンドに悩まされることが多々あります。また、研究室が変わっても起こりますし、周りも結構困っているようです。 私はかなりコンタミには気を使っているほうだと思っているのですが、なかなか原因までわかりません。今の研究室ではフィルターチップも使ってやっているのですが起きます。。。 以前何かで何度もPCRをかけるとかなりエアゾルが空気中にまい、それが原因じゃないかというのを聞いたことがありますが半信半疑です。 また、自分自身のDNAなどのコンタミも、以前菌の遺伝子を見ているときも同様なことが起きたのでどうなのかなっと思います。

(無題) 削除/引用 No.4463-17 - 2007/07/02 (月) 20:17:00 - a 横槍さん Takara BioのSYBR Premix Ex Taqに変更することでdimerを無くすことができました。primerは5種類ほど試し、全てdimer無くなりました。 ちなみに、2stepでPCRは行っています。 我々もはじめはprimer設計やアニーリング温度など、徹底的に検討しましたが改善されず、たまたまサンプル試供で酵素を頂いて、あっさり解決しました。その後、幾つかの酵素ももらい試しましたが、今のところ1番安定に使えてます。 primer dimerで困っている方はprimerの設計は当然ですが、酵素も検討された方が良いと思います。 私は、ABIの酵素は試したことありませんので、ABIとの比較ではありません。

(無題) 削除/引用 No.4463-16 - 2007/07/02 (月) 18:47:29 - 横槍 失礼いたします。 横からaさんへ質問させてください。 aさんの、ある会社の酵素とは実際どこのものでしょうか？ 差し支えなければ、お願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4463-15 - 2007/07/02 (月) 16:46:46 - a ABI−SYBRGREENは昨年と現在で同一ロットでしょうか？ もしかすると、ロット間で何か変更されているかも知れません。 私は、4種類ほど酵素を試しましたが、dimerの出やすい酵素があります。 酵素活性の高いものほどdimerが出やすい傾向にあるような気がします。 不思議とdimerは出たり、出なかったりして我々も困っていました。プライマーを複数設計しても全く駄目でした。 結局、酵素を色々試したとこ、あるメーカーの製品が最も良かったです。50サイクルでもdimerはでなくなりました（他の酵素では30-35サイクルでdimerと思われるピークが出てきていましたが）。 いずれにせよ、コンタミかprimer dimerかをハッキリさせることが重要ですので頑張ってください。 別の増幅産物が出てくる場合にはプライマーを変更するのが良いですが。

(無題) 削除/引用 No.4463-14 - 2007/07/02 (月) 12:54:48 - う〜んと >そんな些細なことでコンタミするのでしょうか、 mRNAの量を考えれば、状況によってはゼロではないでしょうが、可能性はひくいでしょうね。 フィルター付チップを使用していれば、他の要因で一番危険なのは、コントロールに使うプラスミド溶液の飛まつ等がごく微量でもグローブ等を介して、プライマー容器のキャップについてスピンダウンによって混ざることではないでしょうか。

わたしも 削除/引用 No.4463-13 - 2007/07/01 (日) 22:32:38 - 迷宮 リアルさんと全く同じ問題で苦しんでおります。 ＮＴＣの増幅、そして反応後の電気泳動像では、目的遺伝子のバンドと同じくらいのbpの位置にＮＴＣのバンドも見える、という状態です。Dissociation Curveも、ＮＴＣと目的遺伝子のCurveのピークが一致していたりします。私もマスターから複数wellに分注しているのですが、やはりリアルさんが言うように、wellによって増幅が起こったり起こらなかったり、という状態です。私は、いろいろな動物種を用いて、とある遺伝子の発現量を調べているのですが、上述したような現象は、マウスでしか見られない、ということも情報として付け加えておきます。 そんな状況で、今のところ私が一番疑わしいと思っているのは、やはりコンタミです。それも、プライマーへのコンタミ。プライマーを新調し（配列は変えずに）、私よりもずっとモレキュラー実験の手技が正確な人に、私の実験系で、私がいつもやるのと全く同じ液の組成を用いて実験を行ってもらった結果、とても綺麗な結果が出、ＮＴＣでの増幅も全く起こらなかったのです、、、、その後何回かのトライでも、それを裏付ける（手技によるコンタミ）ような結果がいくつもでているという状況です。 今まで散々悩んできたことへの答えが、単なる手技の未熟さゆえのコンタミ、という結末になりそうで、私的にはかなり自信喪失な感じなのですが、、たとえば狙っている遺伝子と同じような配列をヒトも持っていて、実験中に、手袋、汗、唾液等によってコンタミしてしまう、ということもあるのかもしれませんね。 実験手技にはかなり神経を使い（マスクの着用など）、プライマーはかなり細かく分注しておくことをオススメします。 それにしても、そんな些細なことでコンタミするのでしょうか、、、私もいまだに完全に納得したわけではありません。 お互い、うまく実験が軌道にのるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.4463-12 - 2007/06/29 (金) 15:53:55 - リアル kinuko　さん 蛍光物質の沈殿は知りませんでした。 一応酵素も含まれていると思って、SYBRGREENはしっかり攪拌せずに使っていました。均一にする必要があるのですね。 参考にさせていただきます。ありがとうございます。

非常に基本的ですが 削除/引用 No.4463-11 - 2007/06/29 (金) 15:15:00 - kinuko NTCに関しては、やはりコンタミが疑わしいようですね。 リアルタイムはいつもコンタミに悩まされます。 プライマーも同じものから希釈していても、希釈時にコンタミすることもありますし。 「蛍光強度が弱い」に関して、私も一時期苦しんでいたことがありました。 結局、SYBRGREENの蛍光物質沈殿があったことが原因と判明したのですが。 以来、master mixを作成する時は、かなりしつこくSYBRにvortexをかけ、プレート（あるいはチューブ）分注前にも再度vortexをかけて、気を使っています。 非常に基本的なことですが、何か参考になれば幸いです。

さらに追加の報告です 削除/引用 No.4463-10 - 2007/06/29 (金) 12:55:33 - リアル 長いので2つに分けました。 さらに過去のデータを眺めていて気づいた点があるのでご報告します。 リアルタイムPCRでPCRのステージ後にDissociation Stageがありますが、そのDissociation Stageの最初の蛍光強度（PCR後の蛍光強度）が、正常な実験と最近の実験では異なることがわかりました。もちろんウェル間、実験間に微妙に誤差がありますが、正常なころの実験のほうが全体的に蛍光強度が低い傾向があるのです。 また、Dissociation Stageでは温度上昇につれて蛍光強度がだんだん落ちていき、Tm値付近でDNA解離がおこって急激に蛍光強度が落ちるという曲線になると思うのですが、そのTm値付近の蛍光量の減少具合（曲線の傾き）が正常な頃の実験より若干緩やかに見えます。解離曲線がきれいなピークにならない理由がそのあたりになるような気がするのですがどうでしょうか？ 蛍光強度を変えるような変更、例えばSYBRGREENの量を変える、プライマー濃度を変える、テンプレート量を増やすなどの変更はありませんし、機械の蛍光ランプ交換も行っていないのですが、急に蛍光強度が変わるようなことはあるでしょうか？

追加の報告です 削除/引用 No.4463-9 - 2007/06/29 (金) 12:41:21 - リアル PCR産物でのゲルでの確認を行いました。NTCの非特異的な増幅では目的産物とほぼ同じ位置(のように見えるのですが。。)にうっすらとバンドが見られました。DNAをいれたサンプルではバンドは一本に見えました。アガロールでは分離できないのか、元から1本なのかわかりませんが。。 リアルタイムPCR自体はピペット、チップ、チューブを異なるセットで行った結果、NTCの増幅はなくなりました。が、一度しか行っていないのでなんともいえないかもしれません。ただ、DNAをいれたサンプルの解離曲線の異常は変わりませんでした。 トロジェンさんのプライマーダイマーに関するご指摘ですが、 プライマーに関しては実験開始から同じチューブから希釈して使用していました。なので業者の変更はありません。今回新しく注文してからも問題解決にはいたらなったので劣化でもないでしょう。 もともと実験系を組み立てるときにプライマー濃度最適化実験でダイマーの増幅は高いプライマー濃度で見られました。しかし、その増幅と今回の問題の増幅は解離温度が異なります。ダイマーは解離温度が目的産物より低いものだと思っていたので今回の問題はダイマーではないと考えているのですがどうでしょうか？ あと、DNase処理はRNA抽出の際に行っています。その後PCRし、ゲルでDNAコンタミがないかを確認してからリアルタイムPCRという流れです。すみません、言葉足らずでした。ただし、プライマーに関しては配列の都合上、ゲノムDNAも増幅してしまうような配列になってしまっているので、DNAコンタミの可能性もあるでしょう。ただ、実験がうまくいっていたから毎回runに組み込んでいるサンプルがあるのですが、そのサンプルも急に異常が出ています。なのでサンプルの問題ではないと考えていました。

(無題) 削除/引用 No.4463-8 - 2007/06/27 (水) 23:45:35 - トロジェン 私はNo template controlでも不可解なピークが見られるというのが気になります。見られないこともあるということなのではっきりとはわかりませんが、プライマーが原因の可能性があると思います。プライマー合成業者を変えたとか、合成業者が工場移転？したとかはありませんか？ まずはプライマーダイマーが原因である可能性を消すために、プライマー濃度をふってwater templateで試してみてはいかがでしょう？今使用されているプライマー濃度の倍の濃度で、もしプライマーダイマーがみられ、不可解ピークと同じピークならプライマーの純度を疑ってみてはどうでしょう？ 以前一度だけですが、合成業者によって同じ配列のプライマーでも非特異産物の有無が変わったことがあります。 的はずれかもしれませんが、機械の故障でもなくゲノムDNAなどのコンタミでもないのならば、疑っても良いファクターかもしれません。 投稿されているプロトコールを見る限りDNase処理が見あたりませんでしたが、ハラヘリネズミさんのおっしゃるとおりゲノムのコンタミは確認した方がよいと思います。プライマーがエキソンジャンクションに設計されているなら良いですが。

(無題) 削除/引用 No.4463-7 - 2007/06/27 (水) 14:09:14 - リアル ＞テンプレートはDNAでしょうか？ｍRNAでしょうか？ テンプレートはｃDNAです。 実験の流れとしては、 ・キアゲンのPlant Mini Kitでtotal RNAを抽出 ・ABIのHigh Capacity Reverse Transcription Kitを使ってoligodTでｃDNA合成 ・ABIのSYBRGREENでリアルタイムPCR という手順です。ｃDNA合成後に精製して濃度をそろえることは行っていません。 ゲルでの確認は行ってみます。増幅産物が70ベースくらいなので非特異産物とうまく判別できるかどうかわかりませんがやってみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4463-6 - 2007/06/27 (水) 13:56:23 - リアル 目的産物でない解離曲線のピークはNo template controlでも見られます。 しかし毎回全てが増幅するわけではなく、増幅しないときもありますし、プレート内の3反復間でも増幅されるウェルとされないウェルがあることがあります。 しかし、DNAサンプルを入れたウェルに関しては解離曲線は全て異常な形になってしまいます。 プラスミドに遺伝子を組み込んで、ということはやっていないのでわかりません。すいません。

サンプル 削除/引用 No.4463-5 - 2007/06/27 (水) 13:41:25 - ハラヘリネズミ リアル様 機械のトラブルではなさそうですね。 水も試薬も変えたとなると・・・ SYBRをお使いとのことですが、テンプレートはDNAでしょうか？ｍRNAでしょうか？ｍRNAでしたら、ｇDNAのコンタミ等は確認しましたでしょうか？ リアルタイムPCR終了後、サンプルをゲルに流して確認してみて下さい。解離曲線もですが、Ctが３３−３５あれば、３％のゲルで十分にバンドが確認できます。たぶん、これで正体がわかると思うのですが・・・むむむ。 うまくいくことを祈ってます。

(無題) 削除/引用 No.4463-4 - 2007/06/27 (水) 13:29:14 - トロジェンン ちょっと気になったのですが、その不可解なピークはNo template controlでも見られるのですか？それともサンプル（DNA)を入れたときのみに見られるのでしょうか？また、目的遺伝子のみを組み込んだプラスミドなどをテンプレートにしても見られますか？その辺がわかると他の意見がもらえるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4463-3 - 2007/06/27 (水) 11:41:24 - リアル ハラヘリネズミさんありがとうございます。 プレートの清掃に関してはメンテナンスの本を見てやってみましたが結果は異常なままでした。 あと実験には９６wellプレートを使用しています。確かにアプライ中のコンタミは考えられますが、サンプル数を減らして1レーンスケールで実験しても非特異的な増幅は起きてしまいます。 ＞以前動いていたときのCTはどれぐらいだったのでしょうか？ すみません。解離温度のことでしょうか？CTちのことでしょうか？両方書きます。 目的産物の解離温度はうまくいっていた頃も今も77℃くらいです。非特異的な増幅の解離温度が80℃くらいで、今は解離曲線が77℃くらいのピークで、曲線の形が80℃あたりで膨らむ感じになってしまうのです。 CT値はサンプルによってまちまちです。テンプレートの濃度を完全にあわせているわけではないので。しかしreferance遺伝子はだいたい20前後です。テンプレートのCT値は今も変わりはありません。 非特異的な増幅（NTC）は大体33〜35で増幅されてきます。

とりあえず基本的なことを・・・ 削除/引用 No.4463-2 - 2007/06/26 (火) 14:32:54 - ハラヘリネズミ 同じくリアルタイムPCR使用者です。 7300は扉のところから、中が開いて掃除できたと思います。 以前、ABIの技術さんに掃除を薦められた事があったので・・・確認してみて下さい。機械の異常ではないことを祈りたいのですが・・・（お金と時間がかかりますものね） プレートとチューブタイプとどちらをお使いですか？ プレートですと、９６ウェル埋めるまでにコンタミしたりということもあったので・・・ 以前動いていたときのCTはどれぐらいだったのでしょうか？

リアルタイムPCRの解離曲線 削除/引用 No.4463-1 - 2007/06/26 (火) 00:56:38 - リアル 昨年からリアルタイムPCRで実験を行ってきましたが、最近不可解な現象で悩まされています。お知恵をいただけるとうれしいです。 昨年より同じ条件で実験してきたのですが、最近になってNTCがランダムに増幅されることが多く、きれいなピークの解離曲線が描かれません。NTCで目的産物のピークより少し高い温度で解離し、小さなピークが見られることがたびたびあります（増幅されないこともあったり、プレート内の反復間でも増幅の有無はまちまち）。それ以外のwellの解離曲線も全てその小さなピークを含んだ感じのいびつな曲線になります（すみません、うまい表現ではありませんが。。）。はじめはコンタミだと確信して水・試薬・プライマー全てを新調しましたが改善されません。 不可解なのはその実験系自体が一度は最適化した系であり、ある時期まではうまくいっていたのに急に不必要な増幅が起こってきたことです。機器の異常と考えるべきでしょうか？正直、効果な機器なのでそれ以外の可能性を全てつぶしてから検討したいです。 ちなみに実験はABI-7300で行っていて、ABI−SYBRGREENを使用して２ステップで行っています。温度条件はデフォルトで行っていて50C-2min,95C-10min,95C-15sec,60C-1min,40cycleで行っています。 些細なご意見でもいただけるとうれしいです。よろしくお願いいたします。

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