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エタ沈でも落ちる 削除/引用 No.4462-14 - 2007/06/26 (火) 21:44:58 - kawa エタ沈でも強い条件（共沈剤、冷却、長時間遠心）だと50bpでも落ちると思われます。（20bpのオリゴを自分でT4PNK使ってリン酸化していたとき、強い条件だとかなり効率良くエタ沈で回収できていたので）プラスミドが多ければ（10μgとか）、エタノール入れた後、8000rpm1分でも落ちてくるはず。それだと低分子は余りないはずです。でも1cutだけというのはあると思われるのでAP処理はした方がベターと思われます。カラム精製なら普通のやつは100bp以下のフラグメントの回収はかなり悪いので自動的に除かれます。（中には低分子も回収するやつがありますが・・・。（miRNA精製用など））

(無題) 削除/引用 No.4462-13 - 2007/06/26 (火) 21:42:40 - 仔うま 投稿したところで、Aさんが投稿してくださっていたのに気づきました。。。僕が引用したtakaraのHPの内容も制限酵素処理後に行うという前提です。 　　　　　　　　　　　　　　　↓↓↓

(無題) 削除/引用 No.4462-12 - 2007/06/26 (火) 21:39:22 - 仔うま アルカリフォスファターゼを制限酵素を一緒に入れてしまうのは初耳でした。 takaraの制限酵素やCIAPを使用していたので、takaraのHPを見てみたところ、 http://bio.takara.co.jp/catalog/qa.asp?ID=12&c_id=C0147 に 「制限酵素処理後、バッファー置換せずにCIAPを使用すると最適条件に比べ数分の1から10分の1に効率が落ちます。しかし通常、大過剰量使用するので、DNAが5'突出末端なら問題ありません。5'陥没末端ならできるだけバッファー置換し、高めの温度（50℃くらい）で使用してください。」 とありましたので、皆さんが行っているような制限酵素を一緒に入れてしまうのは可能なのだと思います。 大変勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4462-11 - 2007/06/26 (火) 19:03:07 - A アルカリフォスファターゼのバッファーは大抵置換の必要が 無かったように思います。そのあたりはアルカリフォスファターゼ のマニュアルで確認できたはずです。 制限酵素とアルカリフォスファターゼ処理を同時に行っている方が 何人かいらっしゃるようですが私がこのあたりの話を聞いた時には アルカリフォスファターゼ処理は2時間で止めないとまずいと聞いた ことがあります（入れる酵素の量にもよるのでしょうが）。

(無題) 削除/引用 No.4462-10 - 2007/06/26 (火) 17:00:21 - 中年 私の書き方が悪くて誤解を呼んでしまったようです。 ベクターのマルチクローニングサイトのような近接した２つの制限酵素サイトの場合、きちんと両方切れた分子と一方が切れ残って１cutになった分子は、電気泳動上は分けることができないので、例えゲルから切り出しても１cutの分子を除くことはできない。そういう１cutの分子はホスファターゼ処理しておかないと、自己ライゲーションされやすい、というつもりでした。 私もホスファターゼは制限酵素消化時に一緒に入れてしまう派です。double digestionでも一緒に入れています。 ベクター断片の調製のような比較的長いDNAを比較的高濃度（20ng/ml以上）でエタノール沈殿する限りはロスはほとんどありません（Molecular Cloning参照）。どうしても心配ならLPA等の共沈剤を入れれば楽勝です。

(無題) 削除/引用 No.4462-8 - 2007/06/26 (火) 16:38:17 - FAS >また、FASさんは１つの制限酵素の時にアルカリフォスファターゼ処理を酵素処理と一緒にされると>のことですが、bufferは置換されますか？ 置換していません。制限酵素といっしょに放り込んでいます（ますます荒っぽい......）。NEBのやつですとBuffer 1以外ならばどれでもいけます、と書いてありました。他社もだいたい同じではないですかね？

(無題) 削除/引用 No.4462-7 - 2007/06/26 (火) 15:45:11 - 仔うま みなさん、ご意見ありがとうございました。 エタ沈だと収量が悪いので、スピンカラムなど使用されている方が多いのですね。mimiさんのお話ですとエタ沈だけでも50bp以下は取れてこないのでそれだけでも良さそうですが。 ところで、２つの制限酵素できるときに同時に切れない場合、それぞれの酵素に対してbufferの置換が必要だと思いますが、そのような時も皆さんはカラムを使用されますか？ また、FASさんは１つの制限酵素の時にアルカリフォスファターゼ処理を酵素処理と一緒にされるとのことですが、bufferは置換されますか？ 中年さんがおっしゃるようにゲル切り出しをしている間のことでもセルフライゲーションすることを考えると２段階で制限酵素で切るときにはそれぞれアルカリフォスファターゼ処理すべきでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4462-6 - 2007/06/26 (火) 13:24:53 - mimi ライゲーション前にエタ沈した時に、 50bp以下のフラグメントなら、ほぼ回収されません。 心配なら、エタ沈のかわりにカラム型のPCR産物の回収キットなど 使うと、100bp以下のフラグメントが除去できます。 ただ、共沈剤を入れた時や、多量のベクターを切ったのであれば、 話は別かもしれませんが、通常のクローニングには気にしません。 アルカリフォスファターゼは、たいした手間じゃないので やっておいたら良いんではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4462-5 - 2007/06/26 (火) 12:09:59 - FAS 私の場合、 １．制限酵素処理（2つの制限酵素）。1つの制限酵素の時のみアルカリフォスファターゼ処理。この場合、制限酵素処理と同時に行うことが多いです。 ２．PCR spinカラム（Qiagen）で精製。 以上です（荒っぽいですね.......）。

(無題) 削除/引用 No.4462-4 - 2007/06/26 (火) 11:04:45 - 中年 １cutの切れ残りの心配があるので（これはゲルから切り出しても自己ライゲーションされる）ホスファターゼ処理をしています。また、UVへの曝露は極力避けたいので、ベクターをゲルから切り出すことはやっていません。

(無題) 削除/引用 No.4462-3 - 2007/06/26 (火) 10:28:11 - mugimaki 私の場合は、PCRのクリーンアップシステムなどを利用して 精製しています。エタ沈等の方法では収量が減ってしまいますが、 この方法ではあまり減らないのでいいかなぁと思っています。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4462-2 - 2007/06/26 (火) 00:00:50 - A 私の場合、 １．制限酵素処理（2つの制限酵素） ２．アルカリフォスファターゼ処理 ３．電気泳動 ４．ゲルの切り出しで精製 の順に調整しています。やはり切れた断片もそうですが使用後の 制限酵素やアルカリフォスファターゼなどがライゲーションの 妨げになることもあるかもしれませんし、何らかの精製は必要 だと思います。

ベクターを２か所で切った場合の小断片の処理 削除/引用 No.4462-1 - 2007/06/25 (月) 22:22:31 - 仔うま ライゲーションをする前の処理として、ベクターを２つの制限酵素でマルチクローニングサイトを２か所切った場合、小さな断片ができると思いますが、皆さんはあまり気にしないでそのままアルカリフォスファターゼ処理をされますか？それともカラムなどで取り除いた方がよいでしょうか？（短い方の断片も脱リン酸化されるので、混ざっていてもライゲーションの際には問題ないと思いますが、よろしいでしょうか？） ご教示よろしくお願いします。

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