BioTechnicalフォーラム [酵素活性における基質濃度のふりかた。]

酵素活性における基質濃度のふりかた。

No.4456-TOPIC - 2007/06/25 (月) 04:44:28 - もんちゃん

今、酵素を精製し酵素活性を測定しているところなんですが、つまずいて困っています。
本酵素は、加水分解によりペプチド結合を切る作用があるのですが、その活性の測定にアミノ基に結合し発色する2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いて吸光度を測定します。
質問というのは、その際の基質濃度をどのようにふればよいか、分かりません。
一般的に、活性測定における基質濃度の範囲はどのようにすればよいのでしょうか？

あと、この基質は不溶性でほとんどリン酸Bufferに溶けないのですが、溶けない基質の濃度は上澄みをとれば良いのでしょうか？それとも撹拌すればよいのでしょうか、教えてください。
　

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No.4456-6 - 2007/06/26 (火) 19:21:07 - A

> 酵素化学には全く縁のない分野なので全然自信がないのですが、すごく昔に大学で習ったうろ覚えの知識だと、最大反応速度を与えるような、もう飽和しているような基質濃度か、それとも基質濃度に依存して反応速度が増加するような（Kmくらいの濃度）範囲の基質濃度かにより違ってくるのではないでしょうか。（end point assay とかrate assay？）とか。ふつう酵素活性は後者の条件で測定するのではないでしょうか。

仰るとおりです。
私の書き方が悪かったようです。私も酵素活性の実験を始めた当初、
本を読んで理論がある程度わかっても、実際に実験を始めるに当たって
どの範囲の酵素濃度と基質濃度を使えばいいのかさっぱりわからず
困ったことがありました。下の書き込みで私が示した酵素や基質濃度は
実験の取っ掛かりとしてまずどの当たりの範囲で実験を行えば酵素活性を
捉えることが出来るかを示したつもりです。実際のKm値などを求めるには
教科書に書かれているように完全に酵素が飽和するような酵素濃度、
基質濃度を用いなければなりません。その前段階の実験での説明のつもり
です。

ありがとうございます

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No.4456-5 - 2007/06/26 (火) 18:23:17 - もんちゃん

みなさん、親切な回答ありがとうございます。
みなさんの意見を参考にしながらやってみようと思います。

追加

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No.4456-4 - 2007/06/26 (火) 10:00:48 - 素人ですが

ちゃんと溶けてなければ、実際の濃度は、｀｀自分でそうだと思っている濃度｀｀より低いので実験が成り立たないように思います。リン酸buffer以外のbuffer ではだめなのでしょうか？物によっては他の（よく溶かせる）溶媒に溶かして濃い溶液をつくってからそれを希釈するようにしてワーキングソリューションをつくるようなことができるかもしれません。溶解性については試薬の性質をメルクインデックスとかメーカーの説明書などで調べれば何か情報が得られると思います

素人的には。

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No.4456-3 - 2007/06/26 (火) 09:38:16 - 素人ですが

酵素化学には全く縁のない分野なので全然自信がないのですが、すごく昔に大学で習ったうろ覚えの知識だと、最大反応速度を与えるような、もう飽和しているような基質濃度か、それとも基質濃度に依存して反応速度が増加するような（Kmくらいの濃度）範囲の基質濃度かにより違ってくるのではないでしょうか。（end point assay とかrate assay？）とか。ふつう酵素活性は後者の条件で測定するのではないでしょうか。

(無題)

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No.4456-2 - 2007/06/25 (月) 22:00:02 - A

まず基質の溶解ですが多分ペプチド性の合成基質を使われて
いるのですよね？その場合は一般的に両親媒性の溶媒（100%
DMSOが一般的。？％MeOH（濃度が何％だったかは覚えていません）
を使っているのも見たことあります。）に溶かしてたとえば
1-10ｍMのストクを作って、酵素反応時にはそれを反応液（今回は
リン酸バッファーですか）で薄めて使えばOKのはずです。

酵素反応に使う基質濃度に関してですがこれは使われている酵素の
活性と濃度、そして使われている実験装置の感度によっても変って
くるので一概には言えません。一般的には酵素濃度や活性が低い場合は
基質濃度を上げる必要があります。
たとえば自分の経験から言うと数nMのトリプシン（ポジコンでよく
使います）を使った場合、中性付近のpHの条件下でトリプシン様
合成基質の濃度は100nMもあれば十分検出できたように思います。
ですから酵素濃度10-100uMぐらいにして、基質濃度を10uM-10nMの
間で振れば大抵の酵素活性は何処かで確認できると思います。
それを元によりご自身の実験にあった反応系を見つけてください。

酵素活性における基質濃度のふりかた。

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No.4456-1 - 2007/06/25 (月) 04:44:28 - もんちゃん

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