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(無題) 削除/引用 No.4451-11 - 2007/07/13 (金) 13:43:22 - tin 長らく返答せずに申し訳ありません。 私もLisaさんの要領でTrypsinで剥がしたあと、遠心/再懸濁してから、継代していましたが、最後の再懸濁を１ｍLチップで行っていました。書き込みしていただいた後、黄色の200mLチップを用いてほぐしてから播くようにしたら細胞がきちんとほぐれてアグりがひどくなることなく培養できています。チップの穴の径がちょうどよかったのでしょうか？ありがとうございます。 ＞Kawaさん 長時間トリプシン処理後、核から放出されたゲノムDNAによって凝集が起こるというのはどういう現象でしょうか？ ゲノムDNAに細胞がからまるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4451-10 - 2007/07/06 (金) 15:40:07 - Lisa 私も前に飼っており、アグリやすくて手を焼きました。 培地除去→PBS(-)でwash→0.05%Trypsin-EDTA,3-5min,37℃ incubate→培地で懸濁→1000rpm,5min遠心、上清除去→培地で再懸濁→蒔く 最後の再懸濁でyellow tipで念入りにピペッティングしていました。 21Gの注射針で懸濁している人もいました。 個人的な意見では、21Gだと細胞にもダメージがある感じがあるので、22Gの方がいいかもしれません。 trypsinで剥がした後、遠心していますか？ 細胞全般的な印象ですが、遠心/再懸濁した方が、細胞が均等にばらばらになるような気がします。

DNase？ 削除/引用 No.4451-9 - 2007/07/05 (木) 13:53:50 - kawa トリプシン処理が長いと凝集するのであれば、壊れた細胞から放出されたゲノムDNAのせいではないでしょうか？その場合はDNaseが効果的ではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4451-8 - 2007/07/03 (火) 19:19:54 - tin 皆さん、トリプシン処理時間を5〜10分とされているのですね。私は、トリプシンは毒性があるので処理時間を短く・・という先輩のアドバイスにビビッて1分でやっていました。きちんと細胞を剥がすという観点からは必ずしも短時間の方がよいとは限らないかも知れませんね。参考にさせていただきます。 > a さん 私もこの細胞は継代の時に薄く播かない方がよいと聞いたことがあります。次回の継代は実行したいと思います。 フラスコについてですが、私どもの研究室では細胞の維持・継代にはFALCONの10センチシャーレを使っています。フラスコやシャーレの条件も検討してみようと思いますので参考にさせていただきます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4451-7 - 2007/06/30 (土) 15:53:54 - 自分も困ってます 自分も大学院生でSH-SY5Yの凝集で困っている者です。 自分達はSigmaのトリプシンーＥＤＴＡ（Ｔ３９２４）を用いて１０分間のインキュベーション → 血清入りのメディウムを加え、ピペッティング を行っています。 先ほど、インキュベートの時間を５min間に短くして継代を行ってみましたが、逆に凝集が増えてしまいました。顕微鏡観察すると、３〜６個ぐらいの固まりが多く、細胞数のカウントがうまくできない状態になっています。 １０minだと１〜２個のものが多くなり、カウントはできているようになるのですが。 操作が異なるので、１minがどうかはわからないのですが、参考になればと思います。

(無題) 削除/引用 No.4451-6 - 2007/06/30 (土) 15:45:59 - a 参考までに、私はPBSで細胞をwashしないのでトリプシンで５分程度処理しています。 私の印象ですが、継代するときの細胞数が少ないと、あまり良くない気がします。この細胞に関しては、他細胞の時より多めに蒔いて、頻繁に継代していくようにしています。 あと、昔に気になったのはフラスコのメーカーで違いがあるような・・・。 フラスコなら各メーカーがサンプル出してくれますので、検討してみるのも良いかも。久しぶりにSY5Y培養していますが、現在グライナーのフラスコで安定して培養できています。 他のneuroblastomaと比較しても、SY5Yは扱いにくいですよね。

Trypsin EDTA処理時間 削除/引用 No.4451-5 - 2007/06/30 (土) 13:51:40 - tin TrypsinEDTAはメディウム除去後、PBS(-)で洗ってから、0.05%Trypsin EDTAを2mL添加し、37度で１分程度incubationしてから剥がしています。 確かに処理時間が長いと、だまになりやすいと感じていたため、あまり長くならないように気をつけていました。１分の処理時間は長いのでしょうか？ ちなみに皆様はどのくらいの処理されて処理されているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4451-4 - 2007/06/29 (金) 16:39:03 - ｔ Trypsin EDTAはどれくらいの時間処置していますか？ 処置時間が長いとダマになりやすい気がするのですが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4451-3 - 2007/06/24 (日) 15:40:15 - tin 細胞は0.05％のTrypsin EDTA（GIBCOの製品BRL15400-054 ）で剥がしています。 使用している培地はDMEM（ブドウ糖1000mg）です。 血清濃度は５％FCS、５％HSでTotal10％です。 教えていただいたサイト参考にさせていただきます。 初期ロットのものも早速起してみたいと思います。 貴重なアドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4451-2 - 2007/06/22 (金) 21:23:56 - a 細胞は何で剥がしていますか？ あと培地は何を使用していますか？ 私も、SY5Yは凝集し易い細胞だと思っていますが、マリモまではいかないです。 http://www.atcc.org/common/catalog/numSearch/numResults.cfm?atccNum=CRL-2266 を参考に培養しています。 グリア系にも分化するみたいですので、もう一度初期ロットから起こしなおしてみるとかした方が良いのではないでしょうか？

SH-SY5Y細胞の凝集化について 削除/引用 No.4451-1 - 2007/06/22 (金) 17:57:00 - tin 私はヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yを用いて実験を行っている大学院生です。 最近どうもSH-SY5Y細胞の調子が悪く、細胞のaggregationが起こりやすく、挙句の果てには細胞の凝集体がさらに凝集しあって、丸く、‘まりも’のような形になってそのまま生存し続けます。もともとこの細胞自体が凝集しやすいと感じていたので、普段の継代、維持において細胞を剥がした後の懸濁も入念に行っていますが、その‘まりも’の様な凝集体は現れます。 これはまだまだ懸濁が不十分だからなのでしょうか？それとも何かの菌のコンタミネーションが原因なのでしょうか？ このような現象に出会われた方、またそれをどう対処したらよいかご存知の方はどうか私にご教授ください。

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