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(無題) 削除/引用 No.4446-7 - 2007/06/23 (土) 08:10:46 - h どのくらいの培養からDNAをとったのかがわかりませんが、とれてるDNAの量が多すぎだと思います。きれいなDNAをとるために、BACをQiagenのlarge construct kitで抽出してみては？僕の場合、500 mLの培養液から、10 μgくらいしかとれませんでしたが、比較的きれいなDNAがとれてたと思いますよ。それを100ng使ってエレポしてましたが、うまくいかなかったことはないです。僕の場合は、2.5kV、200Ω、25μF、0.1cmキュベットでやってました。

(無題) 削除/引用 No.4446-6 - 2007/06/22 (金) 23:05:24 - ねこたろう transformationに用いるDNAの量も多すぎると効率が下がるようです。多くのBAC　DNAが大腸菌にはいると大腸菌の生育に影響があると思います。 BAC　DNAなのかgenomeなのかの判断は難しいかもしれません。 ちなみに電気泳動はどのような条件で行っていますか？ 大きなDNAはパルス電気泳動、NEBの巨大な分子量マーカーを使えば大きさの推定はできるのでしょうがうちのラボにはそれらはないのでいつもは制限酵素(hindIII）などで切って0.8％アガロースゲル（seaKemのふつうのゲル）で低電圧（ゲルの長さに対して2V/cm程度）で12時間電気泳動、マーカーはインビトロジェンのhigh　molcular　weightマーカーなどを使って簡易的にみています。この条件ならばこのマーカーの上限の48kbp程度までは判別できますが。ちなみにインビトロジェンのHPのHMWマーカーは例では0.4%ゲルで泳動しています。

(無題) 削除/引用 No.4446-5 - 2007/06/22 (金) 16:38:15 - ryo 大腸菌のRNAは、電気泳動すると100bp以下のところに来ます。流しきっている可能性は無いですか？DNAがどれだけあるかは、マーカーとの明るさの比較によって判断することが出来ます。 routineでBACをSW102にtransformationし、うまくいっていますので、具体的なProtocolを書いておきます。 ・BACが入った大腸菌5mlから、アルカリミニプレップしてBACを精製し、電気泳動で濃度を確認し、数十ngあることを確認 ・OD 0.6のSW102 10mlをwashし、plasmid全量を加えて50ulにする ・0.1cmのキュベットを用いて、1.75kV、200オーム、25uFでエレクトロポレーション。time constantは4.5msec位 ・SOCで1hr incubateし、全量をプレートにまく うまくいくと、数十個のcolonyが生えてきますが、2、3個しか生えてこないこともあります。 エレクトロポレーションに使う大腸菌のwashの際、厳格にon iceを守るのがコツだと思います。

(無題) 削除/引用 No.4446-4 - 2007/06/22 (金) 14:28:55 - ct さっそくありがとうございます。 BACプラスミドの精製ですが、ここまで大きなものは扱ったことがなく収集率がよく見えるのは１プラスミド当たりが重いせいかと思っていたのですが、確かに多いかもしれません。電気泳動で流したときにはスメアはほとんどなかったので、あとはゲノムのDNAが混じっているのではないかと思うのですが、どのようにして確かめればいいのかわかりません。何か方法はありますか？ pBskをエレクトロポレーションした時はレスキューした大腸菌を1/10と残りに分けたのですが、後者はくっついてしまって見えませんでしたが1/10の方もかなり密集していたのですが１日目ならまだコロニーが拾えるくらいでした。（プレートは廃棄してしまっていました。） エレクトロポレーションですが、0.1cmのキューベットを使っています．time constantは5msでした。paperでは13kV/cmが一番効率が良いみたいですが、Recombineering用のプロトコールの多くが1.75kV（17.5kV/cm）だったのでこのままやっていました。今度1.3kVで試してみます。ただ17kV/cmでも1/3ぐらいに効率は落ちますが、トランスフォーメーションは起こるみたいなので今の１つもコロニーが生えない状態は他にも原因があるような気がします。 Bioradのページには下のリンクから飛べなかったのですが、オンラインプロトコールの3112_27 Electroporation Protocol, Escherichia coli DH10Bのことでいいのでしょうか？こちらの設定とは電圧以外は一緒です。 BACの取り扱いに関してはvortexと過乾燥はしていないのですが、ピペットチップはそのまま使っていました。これだとvortexしていない意味がないですね。もう一度BACの精製をしなおして試してみます。他にBACの取り扱いに関してアドバイスがあったらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4446-3 - 2007/06/22 (金) 00:41:45 - ねこたろう BACの大きさが大きいようですがelectroporationの条件はキュベットのギャップ（通常大腸菌では０．１ｃｍです）、コンピテントセルの量（0.1cmキュベットでは20ul）、DNAの量（インビトロジェンのコンピテント使用時は100ngくらいがメーカー推薦だったとおもいます。）、電圧、抵抗値、静電容量、time　constant、DNAの品質が関係すると思います。そのあたりはどうですか？大きいBACほど高電圧での導入効率が低くなるというpaperもありますが電圧等も適正なのでしょうか？ http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=306974&blobtype=pdf 条件に関してはBioRadのHPに例がありますが http://www.bio-rad.co.jp/B2B/BioRad/literature/br_lit_category.jsp?BV_SessionID=@@@@0073792749.1182440360@@@@&BV_EngineID=ccchaddlfgfgjlecfngcfkmdhkkdfll.0&categoryPath=Literature%2fBio-Rad+Lit%2fLife+Science+Research%2fGene+Transfer%2fElectroporation%2fElectroprotocols+Online&divName=Life+Science+Research&siteSection=divmanual&searchType=literature&template=/literature/br_lit_cat_display2.jsp また、BACの取り扱い時はピペットチップの先端を切ってshearing（剪断）を防ぐ対策はしていますか（ワイドボアピペットの使用も良いと思います。大きなDNAでは当然vortex等も禁止と考えます）EtOH　precipitation等でのDNAの過乾燥もだめです。

(無題) 削除/引用 No.4446-2 - 2007/06/21 (木) 22:26:21 - ryo BACはlow copyなので、1ug/ulも取れるというのが不自然に思います。 ほとんどが大腸菌のRNAではないでしょうか？電気泳動で確認してみてください。 pBsK 1ngをエレクトロポレーションしてかなり生えたということですが、具体的にはどれくらいですか？エレクトロポレーションがうまくいけば、コロニーとして見えないくらいたくさん生えてくるイメージがありますが。

BACの大腸菌へのトランスフォーメーション 削除/引用 No.4446-1 - 2007/06/21 (木) 21:49:21 - ct 現在、BAC Recombineeringでノックアウトを作るためにBACを大腸菌株にエレクトロポレーションで入れようとしていますが、コロニーが全然生えない状態です。誰か経験がありましたらアドバイスお願いします。 使っているBACは200kb前後です。 BACの精製にはSigmaのMidi用の溶液を使い中和したあと、イソ沈、フェノクロ、エタ沈で1ug/ulになりました。 compitentに用いている大腸菌株はDH10Bから改変されたsw106です。compを作成するときはO.D.=0.6ぐらいでした。 エレクトロポレーションの設定は1.75kV,200ohm,15uFで、BAC DNAを5ug使っています。（ちなみにこのcompでpBsk1ngをエレクトロポレーションした時はかなり生えました。） その後、SOCで１−２時間レスキューしクロラムプェニコール（11ug/mlぐらい）のプレートにまいています。 何をどうすればいいかわからず、困っています。どうか宜しくお願いします。

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