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(無題) 削除/引用 No.4445-6 - 2007/06/26 (火) 13:01:27 - 名無し 単にIPしてプルダウンしますみたいなことならというか取れればいいという感じならべつにそれでいいとおもうけど精製してそれまたなんかに使いますけどみたいなことなら外から遺伝子いれて無理やり発現させていることをかんがえるとこれはやっぱ少なすぎとおもう。蛋白質濃度測定よりもタグの種類とか発現とか精製とかをもう一度ちゃんと考え直した方がいいかもそれでもどうしても回収すくないなら培養細胞ならステブルセルつくるとかスケールupするとかいうことかんがえたほうがいいかもしれない。 蛋白質濃度は小さい石英セル使って紫外部吸収がいいかもでもいろんなものがこの辺に吸収持つから妨害されて正しくはかれないかもしれない、とりあえずバックグラウンドの差し引きは大事とおもう。

(無題) 削除/引用 No.4445-5 - 2007/06/26 (火) 00:05:24 - A PIRCEからmicroBCA　Kitというものが出てます。買う必要はないので まずはWebからマニュアルを手に入れて検出できそうかどうか検討されては。

(無題) 削除/引用 No.4445-4 - 2007/06/22 (金) 10:00:27 - 通りすがり ものすごく細胞内でabundantな タンパク(ヒストンとかアクチンとか)なら bradfordとかでも測れるのかもしれませんが 通常の細胞内ほとんどのタンパクの場合、 哺乳類の10^7細胞数ぐらいから精製したものでもナノオーダーレベルであるのに対して Bradford assayとか蛍光レベルで測定するものや nanodrop,Qbitとかでも、検出レベルはいまだにマイクロオーダーからセミマイクロレベルですから、まあまず、無理でしょう。できたら楽なんでしょうが。 IP buferの影響については、 界面活性剤が入ってればBradfordは影響たしかに受けますが まず、そういうレベルの問題ではないです。 細胞数を100倍から1000倍ぐらいに 増やしてやれば決して不可能ではないですが、普通のラボでは無理でしょう。 現実的だし割りとやられてる方法は、やはりWesternとかの検出法のほうが 圧倒的に高感度なので、 既にタンパク量がクリアにわかってるスタンダードのタンパクを用意して (大腸菌やバキュロなどで合成精製し定量しておく、 あるいは誰かにもらったり買うなりして) 希釈してstandard curveを引けるようにして、同時にIPしたものと一緒に流して、Westernとかして全部検出してstandard curveからIPしたものを定量するパターンでしょうか。 あとは下のかたがおっしゃてるように銀染色とかでできる場合もありますが 通常は、見えるかどうかギリギリのレベルです。

(無題) 削除/引用 No.4445-2 - 2007/06/22 (金) 09:54:41 - Silver SDS-PAGEに流して銀染色し、別レーンの濃度を振ったBSAなどを基準に見積もるのは？

微量タンパクの計測法 削除/引用 No.4445-1 - 2007/06/21 (木) 21:25:47 - スターリングランド SigmaのHA-Immunoprecipitation Kitを用いて、HAタグ付きタンパクの精製をおこない（最後は1xIP bufferでelute)、そのタンパク濃度を測定したいところです。（Ponseauではdetectできず、α-HA抗体によるWesternではECLにて十分な発現がみられました。）BCA assayでは測定不能であったため、比較的微量のタンパクの測定に向いているBradford assayをおこないましたが測定不能でした。 測定できない（検出されない）原因として、1)濃度がうすい 2)SigmaのIP　bufferが悪影響をおよぼしている　などを想定していますが、 教えて頂きたい点として、1)の場合、微量タンパクの計測法はほかにありますでしょうか？　またその際、IP buffer(おそらく弱い界面活性剤がふくまれていると思いますが）などの影響はやむを得ないのでしょうか？ 宜しく御教示のほどおねがいいたします。

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