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(無題) 削除/引用 No.4443-9 - 2007/07/03 (火) 12:05:39 - メロン屋さん MX様 ありがとうございます、返信遅れてすいません。 ご意見を参考に実験をしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4443-8 - 2007/06/26 (火) 05:52:46 - MX 数年前までは山ほどstable transfectantを樹立していたので一言。ただ長いことしていないので勘違いもあるかもしれませんし、細胞の違いもあるかもしれませんがその場合はご容赦を。 まずはG418の濃度はコントロール実験をされているようなので、その濃度（0.4mg/ml）で行ってよいでしょう。私の経験からするとG418を加えるタイミング（1週間後）が遅いと思います。お使いの細胞のダブリングタイムは承知しませんが、私が使っていたほぼ1日で倍加するような細胞でしたらエレクトロポレーション後2日後から選択を始めていました。遅くからスタートすると結局クローン増殖した細胞を異なるクローンとして拾ってしまうのでスクリーニングする割に似たようなクローンしかとれなかったりするからです。ここは少数精鋭で少なくても多様なクローンが得られた方が良いでしょう。 G418の至適濃度は細胞株、亜株、培養条件等にもよって異なるので必ず自分の細胞で予備実験するべきでしょう。私の場合とあるヒトB細胞株で2.5mg/mlのG418が必要な場合もありました。 ただ前の方が言及されているようにGFPの細胞毒性の可能性も経験的にはあるので注意すべきでしょうね。 linearizationは私自身試みたことはありませんが、プロモーター／目的遺伝子／polyAまでの間以外を切るべきでしょうね。もちろん耐性遺伝子の方もプロモーターからpolyAまでの間は切るべきではないでしょう。Ampicilin耐性遺伝子を持っているのならScaIとか？

(無題) 削除/引用 No.4443-7 - 2007/06/22 (金) 09:23:03 - メロン屋さん ＹＴさんコメントありがとうございます。返答は日本語でしつれいします。 最高２mg/mLですね、わかりましたその条件で試してみます。 LinerlizeしたDNAをtransfectするということですが、前のトピックで拝見して、やってみようと試みましたが、plasmidのどの部分で切断すればよいか悩んでいます。 目的の遺伝子部分やプロモーター部位、コザック以外の部分を切れば、何処でもいいんでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.4443-6 - 2007/06/22 (金) 00:26:42 - YT >高濃度、短時間で試してみたいと思います。 Wait!! I think the concentrations you are trying are high enough. I myself have never tried concentrations higher than 2mg/ml. I guess the reason for your failure is not that. Do you linearize the plasmid before transfection? One of my colleague has ever experienced dramatic improvement in expression levels of the protein of interest on stably-transfected cells when he tried linearization of his plasmid before transfection. I think that is worth trying if you did not. Another possibility that comes to my mind is silencing of the exogenous gene.

(無題) 削除/引用 No.4443-5 - 2007/06/21 (木) 18:58:25 - メロン屋さん コメントありがとうございます。単位を間違っていました。すいません、ご指摘ありがとうございます。私が使っているのは、0.4〜1.6mg/mLですね。 この現象はmock transfectでもおきてしまいます。しかし、導入していない（パルスもかけていない）細胞では0.4mg/mlから濃い濃度では完全に死滅します。 ソーティングは、うちのラボでは使えるのですが、無菌状態で使えないので、控えておりました。（抗生物質をいれれば問題ないという意見もいただきましたが） 高濃度、短時間で試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4443-4 - 2007/06/21 (木) 17:36:58 - YT 1600ng/mlで間違いないのでしょうか？　1.6μg/mlてことですよね？ 私が普通用いるG418の濃度は1mg/ml（Invitrogenの50mg/mlの溶液を50倍希釈）以上なので、これは少し低すぎる気がするのですが、ま、1週間以内に細胞が殆ど死ぬということであればちゃんと効いているのですかね。 　 （細胞の種類にもよると思いますが）ちなみにこの濃度では培地は酸性になって黄色っぽくなりますが、stableになった細胞には殆ど影響がありません。 　 GFPを発現してない細胞がﾄﾗﾝｽﾌｪｸﾄされてないものと断言するのに異議はありますが、もし　「ﾄﾗﾝｽﾌｪｸｼｮﾝ無しに耐性を獲得した」　という可能性を考えるのであれば高濃度の薬剤で短時間に叩いてみるのも良いかもしれません。細菌でもなんでも低濃度・長期培養では耐性を獲得する可能性が高いですから。

(無題) 削除/引用 No.4443-3 - 2007/06/21 (木) 14:51:19 - a RBL-2H3細胞ではstable cell line

(無題) 削除/引用 No.4443-2 - 2007/06/21 (木) 12:54:33 - 〜 発現させているタンパク質が悪さをしているようにみえますが、 融合させていないGFPだけ発現させている細胞ではどのような状況でしょうか FACSでソーティングで取れるかもしれませんが、 先にGFPのみを見ておいた方がいいような気がします そのまま発現させられないのならば、誘導出来るプロモーターを使う方法を試してみる価値があると思います ところでトランスフェクションしていない細胞は同じ条件で完全に死ぬのですか？ その確認もかねて 1目的のタンパク質+GFP 2GFP 3トランスフェクションしていないもの でやってみれば何が原因かわかるような気がします

stableなlineの確立について 削除/引用 No.4443-1 - 2007/06/21 (木) 12:41:14 - メロン屋さん RBL-2H3細胞（ラット好塩基球性白血病細胞株）にGFP融合型plasmidをエレクトロポレーションにて導入しています。 stableなlineを確立したく、導入後１週間後から、G418（400ng〜1600ng/1mLmedium）でたたいています。添加後数日で大体の細胞は死にます。 1週間ほど経つと、GFPを発現していない（目的の遺伝子を発現していない）細胞1000に対し、GFPを発現している細胞が1という状態です。 G418の濃度をあげてもこの状況はかわらず、1600ng/1mLmedium以上では培地が酸性になるので、怖くてやっていません。 この状況なので、限界希釈もうまくいきません。 耐性細胞って、できるのでしょうか？ご経験のあるかたや対処法がある方、ご教授願います。

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