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ありがとうございます 削除/引用 No.4440-8 - 2007/06/22 (金) 12:44:32 - m いろいろご意見ありがとうございます。 免疫染色ではモデルラットで減弱していました。 westernでもその傾向が認められたので、 どうやって(半)定量するかが、今の課題です。 とにかく一度やってみます。 今後ｍRNAの発現をRTーPCRで検討しようと思ってます。

別の方法でも 削除/引用 No.4440-7 - 2007/06/22 (金) 02:00:38 - べるび WBの結果を、beta-actinなどを用いて（半）定量的に示し、客観性をもたせ、説得力を高める努力は大切だと思いますが、私だったら、WBの結果だけでなく、その腎臓の免疫組織染色などの結果も併せて示し、その蛋白量の減弱はWB以外の他の方法でも認められることをアピールすると思います。場合によっては、定量が容易なRNAレベルでの結果も示すと思います。あの手この手でやって、いずれの方法においても減弱が認められるという結果を示す方が、説得力が高いように思います。

(無題) 削除/引用 No.4440-6 - 2007/06/22 (金) 01:17:07 - D α-tubulinとかβ-actinとかで一般的に行われているようにやれば良いとおもいます 誰もが定量の正確さには疑問を持っているとは思いますが バンドデータも表示するんだろうしそれで良いと思います 自分が投稿しようとしている雑誌 もしくはCellや三大誌で行われているのを何報か調べて その中から選べば良いと思います WBではないですが、自分はChIPの定量について困った事がありました 三大誌で色々ChIPのデータを見ていると control IgGのバンドの何倍濃くなったかという Fold enrichmentで比較しているデータもあれば 普通にコントロールの条件での値と比較しているFold changeのデータもありました 個人的には良くないと思うInputとの比較もあります Inputの何%がIPされたって言う事らしいんですが… 定量データなんてこんなものですよ データに自信が持てるのなら前例に習ってやれば良いと思います

(無題) 削除/引用 No.4440-5 - 2007/06/22 (金) 01:03:36 - 名無し 差が一点何倍とかのようによく見るとそうみえますが、くらいのちがいだと定量的に論じることに注を払う必要があるとおもうけど、誰が見てももうこれは明らかに違うとかいうかんじだったら定量にそんなにまで神経質にならなくてもいいと思う。あと定量を気にするなら、動物を使っているのでむしろ個体差のほうがずっと重要だと思う。今気にしてるのは単なるWBの再現性の点みたいだけど、本来この実験では定量は、対照群とコントロールの間に有意差がある事を示すことが目的のようにおもう。実験間で定量値にある程度のばらつきあっても、n増やして取りあえず何回かやっていつも有意差があればそれはそんな大きな問題にはならないとおもう。WBは定量性の点で劣るし、シグナル強度はすぐ飽和してしまうので、どうしてもおおざっぱな半定量の域はでない。有意に減少してましたのレベルいいのか、何倍に増えました減りましたと正確に言い切る事が本当に必要かどうかで力の入れ方変わる。どうしても再現性や定量性を向上させたいなら一度検量線描いてみて直線性のある範囲を知った上で、最小限度の蛋白質量でやるくらいしかない。（多すぎると膜上で重なったタンパク質が途中で脱落したり、転写が完全にいかなかったり、シグナルが飽和したりするので、差があってもないように見えたり再現性に大きく影響する）。

誰もが納得する方法で半定量したいのですが・・・・ 削除/引用 No.4440-4 - 2007/06/21 (木) 17:07:08 - m 同じ蛋白量を使用しています。 10μｇと20μｇ流して、当然ですが、20μｇのほうが、バンドがこかったです。 コントロールとモデルラットでは、モデルラットのほうが減弱していまし た。 デンシトメトリーで解析しても、あきらかに減弱しているのですが。 計測値は実験毎にばらつきがあります。 論文ではするにはきちんと客観的？に評価しないといけなと思うのですが、どうするのがいいのでしょうか？ 私が参考にしている論文では、actinとの比で半？定量化していました。 よろしくおねがい致します。

(無題) 削除/引用 No.4440-3 - 2007/06/21 (木) 13:12:00 - 名無し おなじ蛋白質量で流すということではだめなのですかというのはもしアクチン量が変わっていたら（それ以外の蛋白質でも同じ事がいえるけど）定量ガタガタになるなあとか思うからでそれで私はWB終わった後に膜染めて、一応転写OK, アプライ量もOKですけどみたいにしてますがまだおこられたことはありません。それにアクチンすごい量多いからたぶんふつうの量アプライしたら飽和して少しぐらい違ってもみんなおんなじに見えるから結局アクチン用にもう一回すごい少なくアプライしてwbしないといけなくなって何してるか分からなくなるとかおもう。

(無題) 削除/引用 No.4440-2 - 2007/06/21 (木) 11:06:21 - western こことか。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=2283

Weatern blottingでの内因性コントロール 削除/引用 No.4440-1 - 2007/06/21 (木) 10:27:12 - m お世話になります。 初歩的なことで申し訳ないのですが、 ある疾患モデルのラットの腎臓から蛋白を抽出、Weatern blottingを行ってます。目的蛋白はモデルラットで減弱しているようなのですが、 できれば、半定量を行いたいと思っています。 その際、内因性コントロールとしてβ-actinなどを使用している文献が多いようですが、具体的にどのようにしたらよいのかわかりません。 なにかよい本や文献、ホームページ等あれば教えてください。 よろしくお願い致します。

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