BioTechnicalフォーラム [SDS-PAGE後のアクリルアミドゲルからのタンパク質抽出法について]

SDS-PAGE後のアクリルアミドゲルからのタンパク質抽出法について

No.4438-TOPIC - 2007/06/20 (水) 18:16:28 - まさ

質問がございます。
同様なトピックもあったのですが、
意味がよくわからず。。。

粗精製のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥして、
目的のバンドから酵素消化などすることなく、
タンパク質を抽出できると聞いたことがあるのですが、
その方法をご存知の方、いらっしゃいますでしょうか？
透析チューブ内にいれて電圧かければ良いのかなとも思うのですが。
収量はそれほどいらないかなと思っております。
よろしくお願いいたします。
　

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ネガ染ですか

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No.4438-13 - 2007/06/27 (水) 02:59:44 - まさ

しかもそのあと、銀染かぁ。。。
やっぱり回収率は相当悪い印象ですかね。。。
ちょっとトライしてみます。
ありがとうございます。

ゲル抽出時の染色は

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No.4438-12 - 2007/06/25 (月) 21:46:26 - 仕事中

お返事遅くなりました。

CBB染色してしまうとCBBと蛋白質が強固に結合してしまい、抽出できなくなります。
そのため、染色はかならずネガティブ染色（リバース染色）にしてください。この染色は炭酸ナトリウム、イミダゾール、酢酸鉛、SDSと試薬さえ揃えば簡単にできますし、感度もCBBより高いです。

回収率は測定していないので（お恥ずかしい話ですが）、わかりません。
10％～20％程度、と考えています。

私が以前やったときは目的物（40kDaぐらい）が50%程度含まれるサンプルを0.2mg/ml前後に調製し、15ul/laneで3 lane分流しました。
切り出し抽出後の確認は再度SDS-PAGEにかけて銀染色で行えば十分に見られます。

(無題)

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No.4438-11 - 2007/06/22 (金) 13:52:56 - まさ

ということは同一サンプルを二レーン以上流して、
一レーンだけ染色してバンドの位置を確認して、
その他のレーンを切り出せばそこそこいけそうってことですかね。

(無題)

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No.4438-10 - 2007/06/22 (金) 01:16:38 - 名無し

方法や、ものにもよるとおもうけど、何か抽出液中でゲルつぶして拡散で抽出する方法なら、半分回収できたらもう大成功と思っていい。高分子量のものや量の少ない蛋白質だとほとんど絶望的。それと抽出にSDSを使うとあとで除くのが大変で、そこでまたロスする。ゲル抽出の回収率が悪いのは蛋白質にくっついたCBBがどうもくせ者らしいという話を聞いた。

(無題)

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No.4438-9 - 2007/06/21 (木) 19:47:55 - まさ

追伸
やはりＣＢＢ染色では固定されてしまうので、
このような染色法を使っていると思うのですが、
実際ＣＢＢだとどれくらいの収率の低下が見られるのでしょうか？

(無題)

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No.4438-8 - 2007/06/21 (木) 18:02:38 - まさ

仕事中様、お仕事中(？)ありがとうございます。
ちなみに、透析法や上記の方法でどのくらいの回収量(率)になりますでしょうか？
一本のシングルバンドから抽出して数マイクログラム程度回収は可能でしょうか？

すみません

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No.4438-7 - 2007/06/21 (木) 09:12:38 - 仕事中

＞私はゲルの除去濾過するのにはATTO社のミニプレップカラムを使っています。

ミニプレップではなく、アトプレップでした。
ご参考までに（http://www.atto.co.jp/ab1170.html）