>同調できたかどうかをサイクリンなどのウエスタンブロットのみで確認すること
>は、不十分だと思いますか？
自分のとこもFACSがないので同様の問題を抱えております。
FACSの場合、サンプルの細胞集団全体での同調がうまくいてるかどうかを
見れる利点がありますので、そこがウエスタンだけとかだとうまく示せない部分があるので気をつけています。
サイミジンの場合はとくに１回ぐらいだと全体が同じとこではとまりにくいので、特に注意が必要です。
自分の場合はサイクリンやRbのリン酸化やPCNAあるいはBrdUの取り込みなどで免疫染色を行って、なるべく広い視野で多くの細胞の状態がわかるように写真などをとって示したりして、さらにウエスタンブロットなどで、サイクリンの発現などを検出したりしています。
この場合は同調したstageにpositiveなmarker(G1サイクリンとかRbの状態)だけでなく、negativeなもの(G2期やM期のmarker:CyclinBやヒストンのリン酸化とかが検出されないこと)を一緒に示すようにして、できるだけ全体で同調されているのだ、というところを示す必要があります。
あとはリリースしてみてきちんと全体のmarkerなどがshiftしていく部分を示して細胞がおかしくなったりしてないということを出したりもしてますね。
ただこれらだけではFACSのPIで測定するようなDNA量での確認はできないのが難点ですね、細胞の種類によってはサイクリンとかって必ずしも、発現がサイクリックになってなかったりpeakのstageが若干ずれてたりすることあるので、DNAの量とかで見れるのが一番、確実なのでしょうけど。
あとFACSならsubG1などを見てapoptosisになってないことなども示せるので、やっぱりあったらいいなあと思いますが。 |
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