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なるほど。。。 削除/引用 No.4428-9 - 2007/06/27 (水) 03:21:32 - あと一息！ Tさん。 早速お返事ありがとうございます！ Hisogrammを使った方法を担当教官にプレゼンして、 OK貰えたらこれで進めてみたいと思います。 本当にありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.4428-8 - 2007/06/27 (水) 00:07:23 - Ｔ 色々な画像で試せば分かりますが、Analyze > Gels の Plot Lanes は絶対値を示したものではありません。プロット全体がちょうど画面にうまく治まるように縦軸のスケールが自動的に調節されます。あくまで単一の画像の中で何箇所かの領域をピックアップして相対比較するためのもので、異なる画像間の比較には使えません。 Analyze > Plot Profile ならば縦軸の横に絶対値が表示されるので、計算すれば絶対値の総和を求めることも可能は可能ですが、敢えてそのような方法を採るメリットはないでしょう。

もうひとつ教えていただけたら。。。。 削除/引用 No.4428-7 - 2007/06/26 (火) 23:19:42 - あと一息！ Tさん！ Histogrammでもう一度Imageを分析してみました。 Raw画像からRGB−Splitで赤（Cy3）のみ取り出して （赤い部分が白くなるので）、これをEdit/Invert、 Analyze/Histogrammにかけてみました。 HistogrammのListをExcelにコピーして ValuexPixel（Count)でSumを算出 （この場合に、余分と思われる低Valueは入れずに）、 この値を細胞数で割って見ました （AnalyzeParticleで求めた画像あたりのNuculeus数）。 目で見て（Image上および、顕微鏡下）Scoringした強度にも、 この方法で求めた値の割合が一致します。 ただ、この方法をどれだけ信用できるかが定かでありません。。。 ここでひとつわからないのがDensitometryです。 GelAnalysisで計算されるPlotAreaの値はHistogrammの値 とは違うものですが、根本的な違いは何でしょうか？ なんだか込み入った質問ですみません。 でもアドバイス頂けたらうれしいです。 よろしくお願いします！

ありがとうございます！ 削除/引用 No.4428-6 - 2007/06/23 (土) 19:11:12 - あと一息！ Tさん。 詳しい説明ありがとうございます。 実は、「Set Measurements で Area, Integrated Density, Area Fraction をチェックして」という方法を担当教官に見せたのですが、 それでも「背景が・・・」と言われました。 Thresholdを用いると、目で見た感じと、割り出されるResult に違いが出ている感じがします。。。 「OD(光学濃度)も考慮してシグナルの強さを 量るというのとはまた違ってしまう」という担当教官からの指摘もありで。。。 ということで、Densitogrammを表示してくれる GelAnalysisではどうかと検討していたのです。。。 確かに、Analyze > Histogramで強度が低めのCountを差し引けば 背景を差し引いたことになりますね＾＾。 GelAnalysisのDensitogrammとHistogrammを見比べて 検討してみたいと思います。 ソフトウェアでの分析方法が許可されないと、 アナログに顕微鏡下の観察結果と画像を目で見比べた結果を 並べることになってしまうのですが、 ここ２〜３ヶ月考えてきたことなので、 何とか実践できたらうれしいです。 色々ありがとうございます。研究室では誰も手を差し伸べてくれないので、 貴重なアドバイス、よく考えて試しなおしたいと思います！！！ また、よろしくお願いします！

(無題) 削除/引用 No.4428-5 - 2007/06/23 (土) 00:07:37 - Ｔ つまり多重染色した画像から赤色のシグナルだけを取り出して、シグナルの強さも含めて定量したいという事でしょうか。例えば ImageJ の Files > Open Sample > Fluorescent Cells が多重染色像ですから、これを使って説明しましょう。 まず、Image > Color > RGB Split を使って、画像を各色に分解します。以後は (Red) の画像を使います。 単純にこの画像のシグナル部分の面積とシグナル強度を知りたければ、Set Measurements で Area, Integrated Density, Area Fraction をチェックしておいてから Measure を実行すれば、Area が 262144 ピクセル（これは 512×512 の全ピクセル数です）、Int Den が 11911700（画像中の全ピクセルのシグナル総和）、%Area が 73.48%（１以上のシグナルがある部分の割合）と表示されます。つまり、１以上のシグナルがある部分は 262144 × 0.7348 ピクセル、その部分の平均シグナル強度は 11911700 / (262144 × 0.7348) となります。計算すると 61.83 です。 もっと詳しいデータを知りたければ、Analyze > Histogram ですぐに分かります。List ボタンを押せばシグナル 0 が 69508 ピクセル、1 が 7475 ピクセル．．．255 が 494 ピクセルと分かります。これを Excel にでも移して計算すれば、上の Measure と同じ結果が出せます。 しかし強度が 1 や 2 の部分というのは、実際にはバックグラウンドのノンスペの事が多いので、この部分も positive と見なして面積の中に入れると、シグナル面積を実際より過大評価し、平均シグナル強度を過小評価してしまうおそれがあります。そのために Image > Adjust > Threshold を使います。スライダーを動かして、実際の positive シグナルと覚しき部分が取り出せるような閾値を選びます。例えば 50 としましょうか。この時の閾値の値を覚えておいて、上の Histogram のデータから閾値以上の部分だけを取り出して計算すれば、positive signal 部分の面積や平均シグナル強度が分かります。 Measure 機能を使って同様の事をするには、先ほどと同様に Threshold を設定し、Apply ボタンを押して白黒２色の画像を作って、これをマスクとして使用します。最初の (Red) の画像を別に開き、Process > Image Calculator で Image1 に (Red) 画像、Image2 に白黒のマスク画像、Operation として AND を選び、OK を押します。これで閾値以下の部分の画像はカットされます。Histogram を見れば一目瞭然です。あとは最初と同様に Measure すれば、Int Den が 9713975、%Area が 42.71% と数値が出てきます。平均シグナル強度は 86.76 ですから結構違いますね。 以上のようにすれば、画像から値を出すことは一応可能です。算出したシグナル強度と蛋白量が比例しているかというのは、また別問題ですが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4428-4 - 2007/06/22 (金) 22:51:05 - あと一息！ Tさん、Kazuさん、 レスありがとうございます。 実は、扱っているたんぱく質が雲状に広がっている感じで、 Cy3の赤だけをマークするのがとても難しいのです。 「RGBSplitだったら純粋に赤だけが量れかもしれない」とか、 「Thresholdで（これではOpticalDensitｙが量れないことに気づき）」 とか思っている矢先に、 担当教官には、「元々の背景をきちんと取り除かないと・・・」 といわれてしまいました。 先ず、「背景をきちんと取り除く」ということがよくわかっていないです。 雲状のものを量るということで、GelAnalysisFunctionでDensitometrｙ （この場合Image全画面をLaneとして） ができないかと考えたのですが、やはり。背景の問題が・・・。 複雑に考えすぎなのでしょうか？ またレス頂けたらうれしいです。 よろしくお願いします！

Analyze Particles 削除/引用 No.4428-3 - 2007/06/19 (火) 08:36:57 - Kazu 特定の物体(object)のみ抽出するAnalyze Particlesの方法が分からないということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4428-2 - 2007/06/18 (月) 15:10:21 - Ｔ 「取り除く」というのがよく分からないのですが、赤い部分だけを測定すればいいのではないですか？

フリーウェア。。。 削除/引用 No.4428-1 - 2007/06/18 (月) 14:46:38 - あと一息！ たびたびお世話になっています。 免疫細胞化学染色し（Cy3使用）、 たんぱく質量の定量を試みています（Densitometryで）。 研究室の資金不足もあり、何とかフリーウェアでということで、 ImageJを用いていますが、 マニュアルを読んでもわからないことが・・・。 黒い背景ににCy3の赤が映し出された画像で、気になるのが背景。。。 Cy3の色を失わずに、きれいに背景の黒を取り除く最適の方法は、 どうしたらいいのでしょうか？ SubstractBackgroundではCy3が必要以上に削られてしまいます。 元々の画像が２４bitでFFT変換には向かないのでしょうか？ または、ほかのフリーウェアで方法は無いでしょうか？ （また、Photoshopはあります。。。） 何かご存知の方、アドバイスいただけたらうれしいです。 よろしくお願いします！！！

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