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10×Ｍ　2 μl 削除/引用 No.4427-19 - 2007/06/21 (木) 15:09:41 - 通りすがり 僕は最終NaCl濃度だけを考えて下記のようにやってます。 Tris・DTT・MgCl2の濃度はちょっと上がってしまいますが、経験上影響はないようです。 熱処理による不活化はなくてもよさそうですが、大した手間でもないですし。 参考になれば。 10×L buffer 1 μl DNA SacI DDWで10 μlに調整、37℃で反応 ↓ 60℃　15min ↓ SacI反応液　10 μl 10×Ｍ buffer 2 μl 0.1% BSA 2 μl XbaI DDWで総量を20 μlに調整、37℃で反応

ファルメンタス社の制限酵素 削除/引用 No.4427-18 - 2007/06/20 (水) 21:27:38 - オレンジ ファルメンタス社のホームページには二種類の酵素による同時切断に関しての非常に懇切丁寧なガイドがありますので、それに従って行えば、これまで一回も失敗したことはありませんでした。 ご参考までに・・・・ http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html

SacIとXbaI 削除/引用 No.4427-17 - 2007/06/18 (月) 16:08:44 - APE Tさん、geneさんどうも有り難うございます。なんだか、制限酵素の活性評価に関する議論に波及しつつありますが、実際には経験の浅い者にとっては、どの様に使用するのが一番確実であるのか（贅沢を言えば手間と金が掛からないか）というのが一番問題となると思います。ですので、実際にその実験を行ったことがあり、手元に有りそうな試薬を使用してこうすれば比較的うまくいったという情報が非常に有り難い。別に制限酵素の研究をしているわけではなく、飽くまでエンドユーザー、toolとして使用しているので、実験の根幹に影響がなければ、先人の知恵を拝借するのが効率がいいのでは無いかと。 Tさん、geneさん以下のプロトコールで御異存ないようでしたら、このトピックを終了させていただきたいと思いますがいかがなもんでしょう。 揚げ足の取り合いは、日々の会議だけでお腹一杯。 おかしなタイミングでこのメッセージが投稿されませんように。 10×L buffer 1 μl DNA SacI DDWで10 μlに調整、37℃で反応 ↓ SacI反応液　10 μl 10×H buffer 1 μl 0.1% BSA 2 μl XbaI DDWで総量を20 μlに調整、37℃で反応

(無題) 削除/引用 No.4427-16 - 2007/06/18 (月) 16:00:33 - gene ＞えっと、そういう実験も日常的に行っていての話ですけど。 まあこういった「信念」は皆さん持っておられますから あなたの信念に反することを書いたから粘着したということですか。ずいぶん細切れに何度も何度も、ディスカッションの場でこういう事欠きたくないんですが、感じ悪いですよ。 どの実験書にしてもメーカーにしても、バッファーの違う酵素はバッファーを変えて順次切るのが基本であり正攻法だといっています。二種の酵素をcompromiseするバッファのテーブルを乗せているようなメーカーでも、そのことは必ず書いてあります。信念というより、まずは基本に忠実に（特に人にアドバイスするときは）、ということです。

(無題) 削除/引用 No.4427-15 - 2007/06/18 (月) 15:43:32 - RE 下でaさんもお書きになっていますが、DNAが少量でエタ沈によるロスが問題になるようでしたら、LPAなど共沈剤（キャリア）を加える手があります。室温・即時の遠心でほぼ定量的に回収することができます。

(無題) 削除/引用 No.4427-14 - 2007/06/18 (月) 15:42:18 - Ｔ > でもね、少量のプラスミドを切るときなどはいいですが、大量に処理するとき、ゲノムDNAを消化するとき、少ない酵素でいかにきれいに切るかというようなときは、そういうところまで神経を使わなければならないのですよ。 えっと、そういう実験も日常的に行っていての話ですけど。 まあこういった「信念」は皆さん持っておられますから（DTT の安定性の話とか．．．）、あとは各自でお好みの方法を選べばいいと思いますよ。 > あまりにも揚げ足取りにすぎると思うのですよ。 べつに揚げ足取りではなく、XbaI で大量のプラスミドを完全消化する必要があれば、私ならそうします。

(無題) 削除/引用 No.4427-13 - 2007/06/18 (月) 15:22:38 - gene ＞SacIの反応後は熱で失活させずにそのままXbaIの反応へ移行しても良いのでしょうか。 いいと思います。一般的に至適塩濃度より高くする分には切れなくなるだけでスター活性はでません。逆だと非常に危険です。ですから、連続的に切るときは塩濃度の低い方からあげていくのが良いのです。 実をいうと、私もsub ugオーダーのプラスミドを切るくらいなら、Mで同時に消化するだろうな、ということを告白します。ただ、どの酵素をどのバッファーで切っても大丈夫、というのはメーカーのいうこと人のいうことはあまり信用できないし、大丈夫とする基準がまちまちです。自分でやってみてこれならOKという納得、経験を積み重ねる必要があると思います。人にアドバイスするとき、特に経験の浅い人にアドバイスするときは、もっとも正攻法でそれさえ守っていれば万能という方法を薦めます。応用問題は本人がそのきになったら試してみればいいと思っています。 ＞80% 以上の活性があるバッファーならメーカー推奨にこだわらずに日常的に使っていますが、問題になったことはありません。 それはたまたま組み合わせた酵素が寛容なものであったか、運が良かったか、あういはそれだけの精度が不必要な実験だったからでしょうね。 活性が80％なら酵素を余計に入れればすむということで、たいていは酵素過剰使用されますから問題が顕在化しないということもあるでしょう。でもね、少量のプラスミドを切るときなどはいいですが、大量に処理するとき、ゲノムDNAを消化するとき、少ない酵素でいかにきれいに切るかというようなときは、そういうところまで神経を使わなければならないのですよ。 ＞大体ユニバーサルバッファーというシステム自体が、至適条件のそれぞれ違う酵素を無理矢理に数種類のカテゴリーに当てはめている訳ですし。 それは十分承知しています。おおざっぱとはいっても、塩濃度ゼロ(Lバッファー）推奨の酵素を塩の存在下で使うと完全消化出来ないことが多いし、高塩濃度の酵素を塩濃度を下げて使うと多かれ少なかれスター活性がでます。Universal bufferであってもメーカーの推奨バッファーではそういうことが起きないことが保証されています。そのことをいっているのがお分かりにならないはずないと思うのですが、 ＞至適条件にこだわるなら Basal buffer か、それと同等の活性を持つ T+BSA を選択すべきでしょう。 とは、あまりにも揚げ足取りにすぎると思うのですよ。

(無題) 削除/引用 No.4427-12 - 2007/06/18 (月) 15:05:12 - Ｔ もうひとつちなみに、XbaI の至適 NaCl 濃度は 100mM です。この事実からも M buffer こそ正に「妥協した条件」という事が分かりますね。H buffer で活性が低い理由は分かりませんが、Basal buffer と大きく違うのは Tris 濃度 (50mM vs 10mM) と還元剤 (DTT vs 2-ME) です。このデータだけから判断すると、Tris 濃度が高ければ活性が落ちるという可能性もなきにしもあらずです。

(無題) 削除/引用 No.4427-11 - 2007/06/18 (月) 14:58:01 - Ｔ どうせ BSA を入れるなら SacI で切る時から入れておいた方がいいですよ。 SacI の Basal buffer にも BSA は含まれています。

SacIとXbaI 削除/引用 No.4427-10 - 2007/06/18 (月) 14:51:33 - APE Tさんご回答有り難うございます。 ですが、手元にT bufferがないので、いかんともし難いのが現状です。タカラのuniversal bufferのみではもらえないようなので、次の酵素の購入機会にはもらっておこうかと思います。

SacIとXbaI 削除/引用 No.4427-9 - 2007/06/18 (月) 14:43:49 - APE みなさんご回答どうも有り難うございます。geneさん本人からご回答いただけるとは思いませんでした。 XbaIの至適バッファーはM bufferなのでM bufferにできるだけ近づけるようにするにはどうするかと、そればかり考えていました。 H bufferを使用するのが手間が掛からなくて良いと思います。頭の固い私にとってはコロンブスの卵でした。Trisの影響が無いのであれば手元にH bufferがあるので挑戦してみたいと思います。 以下、確認のためプロトコールを記載いたします。ここをもう少しこうしたらいいのではということが有りましたら、ご意見いただけませんでしょうか。 10×L buffer 1 μl DNA SacI DDWで10 μlに調整、37℃で反応 ↓ SacI反応液　10 μl 10×H buffer 1 μl 0.1% BSA 2 μl XbaI DDWで総量を20 μlに調整、37℃で反応 SacIの反応後は熱で失活させずにそのままXbaIの反応へ移行しても良いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4427-8 - 2007/06/18 (月) 14:40:39 - Ｔ 例えば、XbaI は固有の Basal buffer で測定すれば 120% の活性があります。つまり、M(+BSA) という条件は明らかに至適条件ではありません。にもかかわらず M が添付されているのは、ただ単に互換性を考慮しているためか H, M, L をできるだけ優先するというポリシーに従っているに過ぎません。それでも勿論切れることは切れますが、至適条件にこだわるなら Basal buffer か、それと同等の活性を持つ T+BSA を選択すべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4427-7 - 2007/06/18 (月) 14:27:55 - Ｔ > 切れない、スター活性がでるなど（しばしば致命的な）デメリットの方が大きいです 私はそうは思いません。 80% 以上の活性があるバッファーならメーカー推奨にこだわらずに日常的に使っていますが、問題になったことはありません。50% なら考えますが、BamHI (TaKaRa) などは他の酵素と組み合わせて使う場合は H buffer で使うことの方が多いです。もちろんそれで切れます。 大体ユニバーサルバッファーというシステム自体が、至適条件のそれぞれ違う酵素を無理矢理に数種類のカテゴリーに当てはめている訳ですし。 まあどちらでもお好みでどうぞ。

(無題) 削除/引用 No.4427-6 - 2007/06/18 (月) 14:05:44 - gene 引用されている書き込みをした本人です。 Tris bufferの濃度の違いは問題になりません。ちゃんと切れます。 どうしても100 mMにしなければ気持ち悪いというなら、NaCl溶液を用いて塩濃度を調製します（私も、本当はこう習ってそうしていたのですが、今では、出来るだけあるものを使って間に合わせよう、有効利用しようという方向で、、、） 例えば、 10 uL system, L, SacIで消化→1 uL 10xL, 1 uL 1 M NaCl, XbaIを加えddWで20 uLに調整 これまでも何度か主張してきましたが、至適バッファの違う酵素を、一つのバッファで妥協して同時に消化するというのは、多少時間を節約できるというだけで、切れない、スター活性がでるなど（しばしば致命的な）デメリットの方が大きいです。 単一のバッファで一時間二重消化するのと、別々のバッファで連続的に一時間ずつ消化するのとでは大して手間も時間も大して変わらんでしょう。むしろ、スター活性や切れ残りがダウンストリームの実験の妨げになって手こずったり、やり直しになったりするほうがよっぽど疲れます。

１ｘM（TAKARA) 削除/引用 No.4427-5 - 2007/06/18 (月) 13:51:31 - P 私の経験では、同様の状況の時、１ｘMで一度に問題なく切れました。

(無題) 削除/引用 No.4427-4 - 2007/06/18 (月) 13:45:22 - Ｔ SacI - XbaI なら、T buffer + BSA でまとめて切ればいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.4427-3 - 2007/06/18 (月) 13:39:06 - a Trisが3倍濃度程度なら問題ないのでは 私もbufferLとbufferHなら同じような方法でやっていますよ。 それでも、Trisの濃度が気になるのであれば、キャリアを入れてエタ沈すればロスは減ると思います。

(無題) 削除/引用 No.4427-2 - 2007/06/18 (月) 13:38:38 - Ｔ SacI - XbaI なら、T buffer + BSA でまとめて切ればいいのでは。

SacIとXbaI 削除/引用 No.4427-1 - 2007/06/18 (月) 13:24:20 - APE とあるプラスミドベクターとPCR産物を制限酵素SacIおよびXbaIで切断、ligationして大腸菌にクローニングしようとしています。タカラの制限酵素を使用しているのですが、以前のトピックで以下の様なプロトコールが紹介されていました。現在はいちいちエタ沈しているのですが、DNAの量が少なく、出来ればエタ沈等でのDNAのロスを最小限にしたいので質問させていただきました。このプロトコールではXbaIの反応バッファー中のTris-HClの濃度が添付のMバッファーの3倍になりますが、XbaIの酵素活性には影響は無いのでしょうか。また、他にも良い方法があればお教え下さい。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2388より抜粋 > 10 uL system, L, SacIで消化→1 uL 10xH, XbaIを加えddWで20 uLに調整 (タカラuniversal buffer） 10×L buffer(SacI添付） 100mM Tris-HCl 100mM MgCl2 10mM DTT 10×M buffer(XbaI添付） 100mM Tris-HCl 100mM MgCl2 10mM DTT 500mM NaCl 10×H buffer 500mM Tris-HCl 100mM MgCl2 10mM DTT 1000mM NaCl

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