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プラスミドの導入 トピック削除
No.4424-TOPIC - 2007/06/17 (日) 15:04:07 - ちょこ
プラスミドに遺伝子を導入し、細胞にトランスフェクションするのですが、うまく発現しません。
細胞に導入するためには、プラスミドの精製などが必要なのでしょうか？
よろしくお願いします。
　
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No.4424-9 - 2007/06/20 (水) 22:11:51 - 東北太郎
pEGFPを使っているならpEGFP-NとpEGFP-Cを間違えている可能性はありませんか？この二つはコドンがずれるだけでMCSが同じですから入れ間違えると発現しないですね。
やはり一度シークエンスを読んでみるのがいいと思います。

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No.4424-8 - 2007/06/19 (火) 09:35:53 - a
もう少し詳しく書いた方が適切なアドバイスをいただけると思いますよ。

導入できないと発現しないこれらは区別する必要があると思いますが。
まず、必ず発現するとわかっている遺伝子（GFPでも良いかも）を同じkitでplasmidを精製して、発現するか確認された方が良いと思います。

導入はされてるが、発現はしていないということであれば、plasmidのコンストラクトに問題があるんじゃあないでしょうか。シークエンス確認やin vitro translationなど

あと、発現方法の確認に問題はありませんか？例えば抗体が失活しているとか。ポジコンを入れればこれらも確認できると思いますよ。


トラブルが起きたときは、ひとつひとつ確認・解決するしかありませんので、どこにどういう問題点がありそうかご自身でお考えになって、解決策を検討してみてください。これも研究の一部ですから、頑張ってください。

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No.4424-7 - 2007/06/19 (火) 09:10:05 - EJ
同様のキット（キアゲンじゃないですが）でプラスミド取りをして、それでpEGFP-N1を導入して問題になった事は経験がありません。細胞はCOS7でもCHOでも浮遊系でも初代培養のファイブロでも。トランスフェクション方法は、エレポでもリポでも。となると、キット以外のところに問題がありそうですねぇ。

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No.4424-6 - 2007/06/19 (火) 04:12:05 - YT
I usually transfect cells with plasmids purified with a miniprep kit from QIAGEN, and have never had a big problem so far.

For your information, the transfection reagent I am using is Effectene from QIAGEN.

(無題) 削除/引用
No.4424-5 - 2007/06/18 (月) 23:58:08 - COS
細胞は何ですか？
COSなんかだとたいていの精製キットの精製度で大丈夫だけど、気難しい細胞もありますから。

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No.4424-4 - 2007/06/18 (月) 22:23:26 - ちょこ
〜さん、ＥＪさん　お返事ありがとうございます。

ＥＪさんが言うように、キットで取り出しただけで純度が大丈夫かということです。ちなみにベクターはEGFPです。

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No.4424-3 - 2007/06/18 (月) 13:02:36 - EJ
プロトプラスト・フュージョン、ならリゾチームで細胞壁を破壊した状態で細胞融合させて遺伝子導入するので、正に大腸菌のまま細胞に、って状況です。プラスミド発現ライブラリーを導入するのに、大昔やった事がありました。当然お分かりの上で書いているのでしょう。余計だったら済みません。
ちょこさんの書いた事を推察するに、キットでプラスミド取りしただけでは純度が不十分になりうるか？って質問ですかね？

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No.4424-2 - 2007/06/17 (日) 16:32:41 - 〜
大腸菌のまま細胞にかけたらだめですよ。

とりあえず使っているベクターと細胞とトランスフェクション、検出方法などの情報を出してみてはいかがでしょうか。

プラスミドの導入 削除/引用
No.4424-1 - 2007/06/17 (日) 15:04:07 - ちょこ
プラスミドに遺伝子を導入し、細胞にトランスフェクションするのですが、うまく発現しません。
細胞に導入するためには、プラスミドの精製などが必要なのでしょうか？
よろしくお願いします。
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