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(無題) 削除/引用 No.4421-9 - 2007/06/22 (金) 21:03:49 - aaa_tsu 結局、DNA polymeraseを別のものに変更して行いました。 ＞別のHigh fidelityの酵素を使ってみると ＞嘘のように走ることがありますよ。 pwo superyieldでいろいろ条件を振っても出なかったものが、 ほんとに出るもんですね。 綺麗なバンドが出ました。 みなさん、いろいろご意見、ありがとうございました。 ちなみに、Pfx50 DNA polymeraseを使いました。

(無題) 削除/引用 No.4421-8 - 2007/06/21 (木) 20:06:09 - kawa ampliconの内部のGC contentはどうでしょう。高い領域があればやはりベタインやDMSOが効果的と思われます。DMSOは10%まで振ってみてはどうでしょう。またmutationが怖くてそういう酵素を使ってられるのだと思いますが、ExTaqのようなHigh Fidelityまでいかないブレンド酵素でも通常変異は1kbあたり1から２個ですので、たくさんクローンを取るのも手です。（平均1から2のポアソン分布としてシュミレートしてみても面白いです）ただしその分シーケンスをしなくてはなりませんが・・・。

詳しい条件 削除/引用 No.4421-7 - 2007/06/18 (月) 17:06:14 - aaa_tsu みなさんいろいろありがとうございます。 ほしいものの長さは、1.2kbです。 2 mMのMg2+が入っている条件で、 プライマーは0.5uM, 0.2mM dNTPでPwo は2.5Uを入れています。 反応条件は、94℃30s, 60℃30s, 72℃2minで40サイクルまで行いましたが、 ダメでした。 hot startでも行いましたが、だめでした。 ちなみに、プライマーには制限酵素サイトを負荷したものを使っているのですが、これが影響しているんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4421-6 - 2007/06/18 (月) 08:12:52 - 〜 >4 puxじゃなくて、pfxです。

(無題) 削除/引用 No.4421-5 - 2007/06/18 (月) 04:28:40 - ｋ 〜さんのおっしゃるように、マグネシウム濃度を振る、betainを入れる、hot start(taq, primer)などはどうでしょうか。　GC richな配列やゲノムDNAを鋳型にする場合、betainが非常に効果的なことが多いです。 欲しい長さ、実際のPCR reactionのcomponentやprogram等も書かれるともっと詳しいアドバイスが得られると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.4421-4 - 2007/06/17 (日) 22:09:44 - 〜 この酵素に影響しているか分かりませんが、 難しい配列の場合にpuxはマグネシウム濃度を振る必要がありました

(無題) 削除/引用 No.4421-3 - 2007/06/17 (日) 21:51:57 - KO 　自分の経験では、PCRは プライマー・ターゲット配列・酵素 の3つの組み合わせに結構左右されるようです。 　条件を変えてみてもPCRが走らないときは、 別のHigh fidelityの酵素を使ってみると 嘘のように走ることがありますよ。 　あと、ゲノムではターゲットの含量が少ないかもしれないので、 サイクル数をあげてみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4421-2 - 2007/06/16 (土) 15:36:25 - aaa_tsu ちなみに、付属のGC rich bufferを使用しても 全然ダメです。 RTしたcDNAのサンプルを用いると走るのですが、 ゲノムDNAでは、どうも無理みたいです。 なにか、情報をお持ちの方、お願いします。

TaqとPwo DNA polymeraseの違い 削除/引用 No.4421-1 - 2007/06/16 (土) 10:07:25 - aaa_tsu 現在ゲノムDNAからPCRを行っていますが、 Taq DNA polymeraseではバンドが綺麗に出るのですが、 ミスリーディングのより少ないロッシュのPwo superYield DNA polymerase を用いて、同時に行うと全くバンドが出ません。 プライマーダイマーらしきものは出るのですが・・・。 ４％DMSOを入れても変わりませんでした。 その他の対処法を教えてください。 よろしくお願いします。

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