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釣られてみるか。 削除/引用 No.4414-8 - 2007/07/04 (水) 03:43:17 - 774 「バンドのサイズ」はゲル中でのその物体の量を示しています。

アガロースゲル電気泳動について 削除/引用 No.4414-7 - 2007/07/03 (火) 16:49:08 - 弁護士 アガロースゲル電気泳動で出てきるBANDのサイズは何を示しているんですか？

Testing 削除/引用 No.4414-6 - 2007/07/02 (月) 17:50:56 - Testerbcb Helloqju - this is just a testing, dont worry about it

(無題) 削除/引用 No.4414-5 - 2007/06/18 (月) 07:29:21 - gene ＞もしもhigh copy plasmidであるのに、増殖せず、それが恐らくinsertの遺伝子のせいだと思われる場合、何かいい方法はあるでしょうか。 以前のトピックスでもずいぶん論議されていますので、ご覧になってください。 たとえば、 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=3775 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=1983 oriの種類によっては、培養温度を下げるというのが有効だそうです。

良いアイデアは。。。 削除/引用 No.4414-4 - 2007/06/18 (月) 03:35:50 - 修行中 長く培養しすぎることが良くないのは最初に教わりました。　普通に培養しても増えない場合、試しに長時間培養してもやはりうまくいきませんでした。 もしもhigh copy plasmidであるのに、増殖せず、それが恐らくinsertの遺伝子のせいだと思われる場合、何かいい方法はあるでしょうか。　諦めなければいけないのでしょうか。　こうしたらうまくいった、という経験談があれば教えていただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.4414-3 - 2007/06/15 (金) 19:52:05 - coli あまり長く培養すると死菌の割合が増えて、中途半端に切れたゲノムＤＮＡのコンタミが多くなります。

(無題) 削除/引用 No.4414-2 - 2007/06/15 (金) 19:00:53 - gene ＞そして、長時間経ってようやく増えてきたものは一体何なのでしょうか。 一つの可能性は、長時間培養条件に置くと、抗生物質が劣化してきて、プラスミドを持っていない抗生物質非耐性菌が殖えてくること、 もう一つは、環境中の細菌、真菌などのわずかなコンタミが殖えてくること（こういう場合あきらかに大腸菌培養液とは異なる外観になることも少なくないので）ではないかと思います。まさか自然発生というわけではないでしょうから。 ＞制限酵素で切ったときの10kb以上のバンドは、Genomic DNAかと思ったのですが、plasmidが取れるときはまったく見えないのに（わずかに混じっているのかもしれませんが)、plasmidが取れないときになぜ抽出されてくるのでしょうか。 正直なところどうしてなのかはわかりませんが、経験上、pBRのようなlow copyのプラスミドを精製したとき、上の例のような訳のわからないgermが殖えたところでプラスミドを精製しようとして全く取れなかったときに、サイズの大きなぼやっとしたバンドが目立ちます。

クローニング 削除/引用 No.4414-1 - 2007/06/15 (金) 13:52:55 - 修行中 今クローニングをしているのですが、行き詰まり、このサイトでよく似た状況のトピックを見つけたのでアドバイスを頂けたらと思いました。 よく似たトピックはNo.4275です。(最後に一部貼り付けました) ＞　ある会社からｃDNAのクローンを購入　（pCR-TOPO、Amp) 　（この会社からはグリセロールストックが室温で送られてくるようです） ＞　画線し、シングルコロニーを拾い、培養 ＞　非常に増殖が悪く、一晩の培養液からではPlasmidが回収できない ＞　一晩培養液の一部を新しい培養液でもう一晩培養 　　どうにか増え、一応Plasmidが回収でき（それでもいつもより少ない)シー　　クエンスで確認 ＞　PCRで目的遺伝子部位を増幅 　　（Primerにベクターに入れ替えるためのアダプターを付加) ＞　ゲルで切り出し、精製 ＞　大腸菌（TOP10)に形質転換、コロニーを拾い、培養 　　（コロニーは小さめ、一晩培養してもほとんど増えていない） ＞　長時間培養、Plasmidをどうにか得るが非常に少ない ＞　制限酵素（EcoRI)で確認 　　（目的Bandなし、10kb以上のところにちょっとぼやけたBandが見える） 　　（PCRでは確認できなかった) 前に同じ操作でうまくいった同僚の指示で進めているのですが、もう一度やってみてもやはりうまくいきません。　クロラムフェ二コールが手元にないのでまだ試していません。　最初から、ずっと増殖が悪いので、Geneそれ自体が大腸菌の増殖を妨げているのかと思うのですが、その場合は、どのように回避すればよいのでしょうか。　大腸菌を変えて試してみようかと思うのですが（今のラボはあまりいろんな種類は持っていなさそうですが）、何かお奨めはありますか。 制限酵素で切ったときの10kb以上のバンドは、Genomic DNAかと思ったのですが、plasmidが取れるときはまったく見えないのに（わずかに混じっているのかもしれませんが)、plasmidが取れないときになぜ抽出されてくるのでしょうか。　そして、長時間経ってようやく増えてきたものは一体何なのでしょうか。 初心者質問で申し訳ありませんが、どうかよろしくお願いします。 　 −−− ミニプレ後にバンドが検出できません No.4275-TOPIC - 2007/05/25 (金) 11:39:33 - it Bgl-�Uでカット後、電気泳動しプラスミドを確認しようとしたのですが、目的の位置にバンドが検出されず、10kbの位置にバンドが検出されました。 このバンドが何であるかも分かりません。 plasmidをもった菌が「何らかの原因」で殖えなくて、抗生物質耐性菌ばかりが殖えた場合にそうなることがあります。 サイズの大きなバンドはゲノムDNAのコンタミで、普段は気にならない程度のものが、プラスミドがない場合それがとれてきやすいか、泳動で目立ちやすくなっているかだと思います。 培養のときの濁り具合はどうでしたか？　妙に殖えが悪くて、2 O/Nくらいし振ってようやく濁ってきたなんてときは、そういうこと、よくありがちです。 「何らかの原因」には、たとえばプラスミドが毒性のある遺伝子産物を発現してしまう、複製を妨げる配列がある（inverted repeatなんか）があります。また、T2などのファージのコンタミで溶菌してしまっていて、それでも長時間振っていると何かしら殖えてきて、そこからプラスミドをとろうとしてもそんな感じです。かつて企業を通じてdistributeされていたcDNA cloneが、T2ファージに汚染されていたこともありました。

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