BioTechnicalフォーラム [Western Blotにおける多量体タンパクの単体化]

Western Blotにおける多量体タンパクの単体化

No.4404-TOPIC - 2007/06/13 (水) 13:48:27 - WB

あるタンパクについてWestern Blotを行ったところ、
目的のサイズの他に２倍、４倍の大きさの位置にバンドが検出されました。
ペプチドを用いた吸収実験で全てのバンドが消失したことと、
構造解析から４量体を形成しうるとの報告があることから、
2倍、４倍のバンドはそれぞれ、２量体、４量体のバンドである可能性を検討しています。

今後の予定としては、泳動前のタンパクを高濃度のDTT処理することで単量体のみを検出できないか検討する予定です。そこで、このように多量体の可能性がある場合、DTTで還元する以外に単量体化するような試薬や方法はありますでしょうか？また、ペプチドの吸収実験以外で多量体であると判断できる方法はありますでしょうか？
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全9件 ( 1 ～ 9 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.4404-9 - 2007/06/15 (金) 06:56:52 - A

なんかのついででいいので、SDSの濃度4%くらいまでを上げて蛋白質濃度はいつもの1/5～1/10くらいにして（βMEは入れといて下さい）、１日～２日くらい室温で放置したものと、今までどうり処理したものとをいずれもboilingなしで電気泳動で比較してみてください。それでモノマーが多くなっていれば、（オリゴマーが少なくなっていれば）たぶんSDSに比較的レジスタントなアーティフィシャルなコンプレックスを作りやすい蛋白質なのでしょう。時々ありますそういうやつ。その蛋白質の性質なので何ともしがたいのですが、SDSとともに8M尿素を入れるといいとか（グアニジン塩酸塩はSDSと混ぜるとかたまるのでダメ）、あらかじめ蟻酸処理（beta アミロイドなどの固まりを溶かす時使うらしい）するといいとか、高濃度アルギニン処理が効果的とか言う話も聞きます。もちろんこれらはケースバイケースなので自分の蛋白質にはどれがいいかは試してみるしかないとおもいます。
SDSは確かに極めて強力な蛋白質変性剤ですが万能ではないです。この問題がプロジェクトの進行において、完全に単量体にすることが必ずしも必須でないならば（単に上の方のバンドがどうも気になるということだけなら）、ここに時間を費やすのは得策でないかもしれません（これやり出すときりがないので）。

(無題)

削除/引用

No.4404-8 - 2007/06/14 (木) 21:59:42 - gene

構造解析から４量体を作りうるといっても、SDSで処理すると立体構造は解けているはずですしね。それでも成立する多量体なのでしょうか？

multimerをmonomerにする方法としては、教科書的には尿素、グアニジンなどで変性するとか凍結融解をするとかがありますが、SDSをかませるという処理もそれに負けていないはずです。

S-S結合もDTTで外れているはずですし。一般的なサンプルバッファだと100 mM DTTだと思いますが、40 mMで十分かどうかは？　それは高濃度DTTでテストするという結果まちということで。逆に非還元で4量体のバンドが増えるかどうかをみるとか。

あとはみなさんも危惧しているように単にaggregateしているんじゃないかということなんですが、サンプルはheterogenousなタンパク質が混在しているlysateのようなものでしょうか、あるいは目的のタンパク質を精製・濃縮あるいは高発現しているものでしょうか。後者なら、aggregateを生じたときmonomerの分子量の倍数でバンドが出る可能性は考えられます。

別のトピにもあるように、タンパク質によっては（疎水性の高いタンパク質の場合）ボイルによってaggregateを生じることが知られています。ボイルではなく中庸な温度での処理は試しましたか？

(無題)

削除/引用

No.4404-7 - 2007/06/14 (木) 17:47:05 - R

ゼロ距離架橋の架橋試薬で処理したサンプルをサンプルバッファーで溶解してSDS-PAGEしてみて、２量体、４量体のバンドが増えるかどうか調べてみるとかは駄目ですかね。

(無題)

削除/引用

No.4404-6 - 2007/06/14 (木) 12:34:28 - A

SDS-PAGEで多量体が現れたからといってかならずしも全てのジスルフィド結合が完全に還元しきれていないという可能性ばかりではないと思います。他の種類の共有結合かもしれないし非共有結合でくっついたままなのかもしれません。変性条件下で40mMのDTTで処理しているので、還元不十分という可能性は大きくないように思います。アイオードアセトアマイドを使えば再酸化（再結合）の可能性はある程度排除できるでしょう。もともと多量体を作る性質の蛋白質ということなので、たぶん単に非共有結合でアグッてるのでは？と思います。

(無題)

削除/引用

No.4404-5 - 2007/06/14 (木) 11:09:45 - page

目的遺伝子ののノックアウトがあると良いと思いますが、いかがでしょう。
ペプチド吸収で完全にノンスペの可能性は棄却されるでしょうか。
もし、目的タンパク質がS-Sで多量体を形成するなら、DTT非処理区と処理区で
比較した場合、処理区でモノマー量は圧倒的に増えるはずです。
完全にモノマーにするというより、むしろ非処理区との比較が大事だと
思います。あと、レドックス関係のレビュワーにまわると、細胞破砕中の
酸化を指摘される可能性もあります。N-ethylmaleimideやIodoacetamideを
抽出バッファーに加えて同様の実験をし、アーティファクトでないことを
確認するのが重要かと思います。

(無題)

削除/引用

No.4404-4 - 2007/06/14 (木) 01:21:42 - D

以前５分のboilでは何ものかと複合体を形成していたものが
１０分、２０分と長時間boilすることでキレイに分離できるようになったものがありましたよ

(無題)

削除/引用

No.4404-3 - 2007/06/13 (水) 17:21:09 - WB

ご返答ありがとうございます。
通常のSDS-PAGEで、DTT濃度は40mMで行いました。
ジスルフィド結合以外の可能性を考えた場合、Western Blotにおいて添加試薬も含めて結合を切断するような方法はあるのでしょうか？

(無題)

削除/引用

No.4404-2 - 2007/06/13 (水) 16:30:44 - A

多量体が検出されたのは通常の還元条件下でのSDS-PAGEなのでしょうか。もしもそうであれば多量体形成の原因はジスルフィド結合よりむしろ、非共有結合も含めていろいろな可能性を考えたほうがよいのではないでしょうか。