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(無題) 削除/引用 No.4398-5 - 2007/06/12 (火) 13:29:48 - teno ＞Mさん ご返答ありがとうございます。 解決できました。細胞の数が多かった為でした。Dishに加えるBuffer RLTを1.5mlにして、カラムに加える量を600ulにし、他は全て同じプロトコールで行ってみたところ高純度で約1.5ug/ul(30ulで溶出）のtotal RNAが得られました。ほっとしております。 きっと以前にやった時は、細胞を撒くのが下手だったので、Dishの真ん中に集まってしまい、コンフルエントだと感じても、実際の細胞の数が少なかった為、上手くRNAを取れたのだと思います。 アドバイスをしてくれた、まいけさん、Ｍさん、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4398-4 - 2007/06/12 (火) 13:00:27 - M ライセートの量が多すぎませんか？ 遠心も室温でしてますよね。

(無題) 削除/引用 No.4398-3 - 2007/06/11 (月) 15:33:48 - teno ＞まいけさん ご返答ありがとうございます。しっかり調整しているつもりでしたが、それは分からないですね。うまく出来ていないので自身もないです。 これから再度RNA抽出を行うので70%EtOHを新しく作成しようと思います。 自分で気付かない初歩的なミスも考えられます。他にもどんな事でも良いのでよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4398-2 - 2007/06/11 (月) 13:48:26 - まいけ 70％エタノールは大丈夫ですか？ 水とエタノールの比率を間違えて回収できなくなった知人がいました。

QUIAGEN "RNeasy Mini Kit"による細胞からのRNA抽出 削除/引用 No.4398-1 - 2007/06/11 (月) 13:18:22 - teno 大変困っています。どうかよろしくお願いします。 QUIAGENの"RNeasy Mini Kit"を用いたRNA抽出を行っているのですが、収量が悪くRT-PCRを行うのが困難になっています。(20ng/ul-40ng/ulしか抽出できませんでした。以前は1ug/ul以上取れていました。) 以前にやった時は問題なくできたのですが、突然できなくなりました。 試薬やカラムが古くなった為かと思い、新しいのを買って再度行ったのですが、やはり収量が悪いままでした。 簡単なプロトコールを以下に書きます。細胞はPC12です。 １．10cm dishで60-70%コンフルエントになったところで培地を捨て、Buffer RLT(10ul/ml β-メルカプトエタノール)を600ul　dishに加える。 ２．ライセートをスクレイパーでかき集め、1.5ml チューブに移す。 ３．21-gaugeの注射針でホモジネート ４．以降の操作は添付にあるプロトコール通りに行っています。 DNaseI処理を専用の酵素を使ってカラム上で行っています。 最後の溶出は水を加えた後、10分室温でインキュベートしています。一度溶出した後、その溶出液を使って再度溶出しています。 本当に困っています。うちの研究室ではRNA抽出を行っているのが僕しかいません。誰か、アドバイスをお願いします。

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