全31件 ( 21 〜 31 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

DTT 削除/引用 No.4396-11 - 2007/06/13 (水) 10:55:09 - K2 ＞ただDTTは強い還元剤ですが、不安定な試薬で溶液状態では長持ちしません。熱にも弱いので、boilなども出来ません。 ＞それ、本当ですか？　Molecular Cloningほか多くの教科書で、DTTでbiolになっていますし、1 M溶液を小分けして凍結保存でいいことになっています（実際それで大丈夫です。DTTは酸化すると色やにおいですぐわかりますから）。 不安定です。ボイルしても意味ありません。といいますか、ボイルしなくても還元作用を発揮します。私はDTTを用いるときはボイルせず、メルカプ トエタノールを使うときのみボイルします。 出典は有機化学の教科書しか思いつかないです。溶液にしたとたんに還元剤として働き始めるので、保存が利かないのです。

(無題) 削除/引用 No.4396-10 - 2007/06/12 (火) 13:27:36 - gene ＞ただDTTは強い還元剤ですが、不安定な試薬で溶液状態では長持ちしません。熱にも弱いので、boilなども出来ません。 それ、本当ですか？　Molecular Cloningほか多くの教科書で、DTTでbiolになっていますし、1 M溶液を小分けして凍結保存でいいことになっています（実際それで大丈夫です。DTTは酸化すると色やにおいですぐわかりますから）。 それにBoilした時点で還元剤の役目は終わっていて自らは酸化されるわけで、それを越えて長持ちする必要もないわけで。どうも迷信ぽい思えてしょうがないのですが。よろしかったら出典を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4396-9 - 2007/06/12 (火) 12:52:09 - A bMEは５xSBには入れてません。試料とSB をまぜて泳動用試料にしたものにだいたい5%くらいになるように入れてます。bMEの代わりにDTTも使えます。ただDTTは強い還元剤ですが、不安定な試薬で溶液状態では長持ちしません。熱にも弱いので、boilなども出来ません。どうしても加熱したいとしてもせいぜい55Cくらいが限度です。

(無題) 削除/引用 No.4396-8 - 2007/06/12 (火) 07:49:58 - テイオーライデン 2-MEを加えた状態の5×を分注して凍らせて使っていますよ。 50% glycerolがネックということは全く感じませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.4396-7 - 2007/06/11 (月) 19:01:53 - K みなさま、アドバイスありがとうございます。 >gene 様 ご丁寧な回答ありがとうございます >還元剤を少なめにするか、2-MEではなく濃いDTTを使う、 >濃いTris buffer stockを使う やはり濃いストックを用いるのですね あとは、濃いストックを調製する手間と、TCAする手間との比較ですね >カナマイシン 様 なるほど、スクロースですか スクロースを用いたサンプルバッファーの処方を教えてもらえないでしょうか？ >a 様 >Glycerolは、35%（final 7%）で十分だと自分に言い聞かせています。 final 7% でサンプルはウェルの底に沈むでしょうか？ いや、沈んでいるのでしょうね。 一応、処方を教えてもらえないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4396-6 - 2007/06/11 (月) 17:21:52 - a 5Xを作るときは、 SDSを粉末で入れます。 Tris-HCl（pH6.8)は、1.0 M溶液をストックとして、（ゲル作りにも）使用しています。 Glycerolは、35%（final 7%）で十分だと自分に言い聞かせています。

(無題) 削除/引用 No.4396-5 - 2007/06/11 (月) 17:12:09 - カナマイシン GlycerolのかわりにSucrose、いいと思いますよ。 当方、Native PAGEのバッファーとして10xのものを調製して使っていますが、 GlycerolでなくSucroseを使っています。 もちろんNativeなのでSDSと還元剤は抜いてます。 この２つもクセモノだとは思いますが、 少なくともGlycerolのネバネバからは解放されると思います。

(無題) 削除/引用 No.4396-4 - 2007/06/11 (月) 15:39:17 - gene 2-MEまたはDTTを加えた終濃度が○xということなので、そう簡単ではないと思います。 多少のバリエーションがあるのかもしれませんが、わたしはMolecular Cloningにある組成したがって（いるとおもいますが）、 2x Laemmli samplple beffer 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) 4% (w/v) SDS 20% (v/v) glycerol 0.2% (w/v) BPB 0.2 M DTT or 20% (v/v) 2-ME (~3 M) なんですが、還元剤ぬきで0.8 volになるように作ってストックして、使う前に0.2 volの還元剤を加えて2xの完成品にしています。たとえば、 1 mL 1 M Tris-HCl 0.4 g SDS 2 mL glycerol 0.02 g BPB water to 8 mL としておいて、2 mLの2-MEまたは1 M DTTを加えると10 mLの完成品です。 これを5xで10 mL作ろうとすると、glycerolが5 mL、還元剤が5 mL入るのでもういっぱいいっぱいです。4xでぎりぎりですかね。 還元剤を少なめにするか、2-MEではなく濃いDTTを使う、 濃いTris buffer stockを使う glycerolではなく他の固形試薬（たとえばショ糖）で比重をつける とかするとあるいは5x くらいはいけるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4396-3 - 2007/06/11 (月) 15:20:38 - K A 様、ありがとうございます 粉末、もしくは原液からつくるとなると、ネックはglycerolでしょうか？ A 様は実際にそのような組成でSDS-PAGEを実施した経験はありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4396-2 - 2007/06/11 (月) 13:11:56 - A まず１xのSDS-sample bufferの組成を見てみましょう。0.0625M Tris-HCl, 2%SDS, 10% glycerol, BPB適当量 (pH6.8)。人により多少の違いはありますがだいたいこんな感じだと思います。５X溶液とは各成分の濃度を５倍にした溶液です。各濃度を５倍にすると0.31M Tris-HCl,10%SDS, 50% glycerol, BPB (pH6.8)となります。各成分のストック溶液を混ぜなくても粉末から調製しても同じ事です。 これでよいのではないでしょうか。濃いので少し溶けにくいかもしれませんが。

Sample buffer 削除/引用 No.4396-1 - 2007/06/11 (月) 12:30:23 - K SDS-PAGEで用いる2xSample Bufferの組成は、 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 2 ml 10% SDS 4 ml glycerol 2 ml deionized water 0.8 ml 1% BPB some drops で適当量分注して store at -20℃、使用前に2-MEを加える というのが定法だと思います(2-MEに関しては差異があるかもしれません) (TCA以外の方法で)どうしても供試するタンパク質を多くしたい、という場合に、 ２xではなく、5xや10xなどのsample bufferを調製して使う、 というようなことをやっている方はいらっしゃらないでしょうか？ よければ、そのsample bufferの組成をご教授願えないでしょうか？

全31件 ( 21 〜 31 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---