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(無題) 削除/引用 No.4372-11 - 2007/06/22 (金) 01:29:58 - D カバースリップには最初油がついています カバースリップ同士がくっついて剥がれなくなるからです しかも通常のものは何も表示していない普通のものでも 何らかのコートがしてあります これはそこまで神経質にならなくても良いとは思います うちのラボではシェーカーで100%EtOHを1晩 70%EtOHに置換してから1枚ずつ埃がつかない布かキムワイプみたいなもので拭きます その後オートクレーブか乾熱滅菌して使っています 細胞を接着させる時には Poly L-ornithineかPoly L-lysineで1晩コートして使うか さらにそこにfibronectinやlamininコートして使っています 拭くのが面倒くさくてやっていない人もいるようですが だいたいみんな頑張って拭いています 拭いた跡にオートクレーブや乾熱を何回もやると コートがなくなっているのでくっついて割れるまで取れなくなります 使いきりぐらいで用意するのが良いです

便乗質問させてください 削除/引用 No.4372-10 - 2007/06/19 (火) 12:39:20 - 蛍光顕微鏡 確かにガラスの場合は接着性に苦しむ事があります。カバーグラスでも同様な事があるような気がします。ある本には、それを防ぐ意味で確か塩酸エタノールか何かで洗浄し、使用するといった方法を紹介されていたような気がしますが、これは何のためなのでしょうか？ バーナー等であぶって使用するだけではいけないのでしょうか？ またどなたか、その方法をご存知のかたは、教えていただけないでしょうか？

接着しました！ 削除/引用 No.4372-9 - 2007/06/14 (木) 22:17:58 - 東北太郎 結局のところ、IWAKIのディッシュで �@　poly-D-lysineの濃度を50μｇ/ml→100μｇ/mlに �A　細胞を撒いた4時間後にmediumを交換して接着していない細胞を除く この二点を変更することで接着するようになりました。live imageも問題なくできているようなのでデータを取っていきたいと思います。 レスをいただいた皆さん、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4372-8 - 2007/06/11 (月) 13:49:20 - あかね 当方、ガラスボトムdishを使ってHelaを蛍光観察(live imaging)したことあります。松浪のnon coat ガラスボトムdishをpoly L- Lysine (sigma)でコートして使用していました。またHuh-7細胞はLysineだと細胞が剥がれやすかったので、 コラーゲンでコーティングしました。確かMBのrat tail colagen type Iだったと思います。 おそらくコーティングがうまくいっていないのではないかと思います。 コスト面からも自分でコーティングできる様になっておいたほうが良いでしょう。頑張って下さい。

炭焼きガラス 削除/引用 No.4372-7 - 2007/06/11 (月) 13:08:15 - 香子ちゃん ガスバーナーでカバーグラスを少しあぶり炭が付いた状態にします。炭の付いた部分に細胞をまき、普通に培養したり、観察できます。細胞はつきやすいですが、炭の影響が心配です。

(無題) 削除/引用 No.4372-6 - 2007/06/08 (金) 10:58:11 - 東北太郎 〜さん、LCIさん丁寧な解説ありがとうございます。 とりあえず松浪のサンプルをもらえることになったので(コート済み、コート無し両方）試してみようと思います。 カバーグラスを入れる方法は焦点距離の問題があるのでやってみなければ観察可能かわからないですが、他の方法で駄目なら試してみる予定です。 結果が出たらまた報告をupしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4372-5 - 2007/06/08 (金) 08:11:04 - 〜 >それは観察前にカバーグラスを取り出し、固定、封入してから観察する、という意味でしょうか？ 今使っているガラスシャーレにカバーグラスを置いて、 その上で細胞を飼ってそのまま観察することは出来ませんか？ もちろんガラスシャーレをいろいろ試す方がいいですが、 カバーグラスの方がより簡単にたくさん試すことが出来ると思います。 ちなみに私が使っていたカバーグラスはIWAKIのものでした。 コートされていない細胞培養表面処理のディッシュに入れて、 カバーグラス部分とディッシュ部分で貼り付きに違いは感じられませんでした。

接着してくれー 削除/引用 No.4372-4 - 2007/06/08 (金) 02:33:47 - LCI 　経験談として、松浪ガラスでは接着も増殖も悪かった細胞が、イワキでは上手く接着＆増殖した事があります。（逆もあると思います） 　松浪にサンプルを頼めば送ってもらえる（出入りの営業さんに頼んでも可）ので、ディッシュの比較をするのも一つかもしれません。 　接着＆増殖したと言っても、ガラスとプラの境界とか、端っこのプラの方が明らかに細胞が接着しやすかったのを覚えています。 　コーティング処理をするのは、別のin vitroデータとの整合性が異なる様な気がして、敢えて何も処理は行いませんでした。（ガラスベースかプラベースかの違いだけにしたかった） 　そこで、 �@多めに細胞を撒きました（35mmディッシュには多すぎるぐらい） �A数時間後にゆっくりディッシュを洗い、先に接着した細胞だけを残して、沈むのが遅かった細胞を取り除きました。 �B観察に程よい密度で細胞が接着しているエリアを探して観察しました。（どうしても撒き方は均一にならないでしょ・・プラディッシュでも。だから、高価だけどガラス面の多い２０mmガラスベースを使って、よい密度の場所に当たる確立を上げました。対物レンズで実際に見える面積なんて狭いエリアなので、どこかには細胞がバラバラに接着しているエリアがあるはず） 　観察するときには、早めにホットチャンバー？をセットして、観察中に顕微鏡本体の温度が変化しないように注意が必要です。顕微鏡の金属も熱によって膨張することがあります。仮に金属が10nmだけ膨張した場合でも、対物レンズを介して観察している細胞のピントは、対物レンズの倍率の積で影響を受けます。席を外して1時間後に戻ってみたら、ピントがズレズレなんでガッカリすることが多々ありました（特に自動設定で一定時間ごとに画像取得をするように設定していた時には、ピントが徐々にズレていく様子が膨大な画像ファイルとして取得できました（涙）あくまで個人談です） 　リジンコートでくっ付かないのは、細胞の問題？コート処理の方法が悪い？リジン処理済のガラスベースディッシュを購入してみるとか？

(無題) 削除/引用 No.4372-3 - 2007/06/07 (木) 18:57:35 - 東北太郎 それは観察前にカバーグラスを取り出し、固定、封入してから観察する、という意味でしょうか？ 現在行っているのは生細胞を培養しながらの観察なので、固定はできません。 違っていたら申し訳ありませんが詳しい解説をお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4372-2 - 2007/06/07 (木) 17:52:53 - 〜 プラスチックディッシュの中に、カバーグラスを置いて、 その上でHeLaを飼っていたことがあります。 プラスチックの蛍光を抑えるためにガラスディッシュを使っているのでしたら、 ガラスディッシュの無蛍光のカバーグラスを置いて観察できませんか？

ガラスボトムディッシュでの細胞培養 削除/引用 No.4372-1 - 2007/06/07 (木) 17:37:15 - 東北太郎 細胞分裂の様子を倒立顕微鏡で観察するためにHeLa細胞をガラスベースディッシュ(IWAKI)で培養しているのですが、細胞のガラス面への接着性が悪く観察前に死んでしまいます。ポリ-D-リジン 50μｇ/mlでのコーティングも試しましたが接着性はあまり改善されませんでした。 何か改善策はないでしょうか？

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