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Aさん有難うございます 削除/引用 No.4365-6 - 2007/06/25 (月) 13:34:04 - V4 Aさん転写とスポットのマッチング法に関するアドバイス有難うございます｡ マッチング方法は参考にさせて頂きます。 転写に関しては、ミリポアの取説よりも電流の値を高く､且つ転写時間も1.5倍長く泳動していたのですが、、、。疑問点が多かったんので、２次元をおこなっている研究室に聞いたところ、タンク式を用いて低電流、オーバーナイトで転写しているとのことでした。セミドライでは、難しいのかもしれません。 タンク式を購入して実験をやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4365-4 - 2007/06/23 (土) 01:41:30 - A 高分子量の蛋白質の転写が総じて悪いようなので、転写時間や電流値の不足でしょう。メタノールやSDSも転写を左右する場合もないことはないですが、それはなにかある特定の蛋白質に関して起こる事であって、ある分子量領域のものがみなジェネラルに写らないという事にはならないと思います。たいていの人は、深く考えずTris-glycine系buffer＋20% MeOHでやって上手くいってると思います。2-Dゲルということなので、１－Dゲルより面積は大きいですね。使っている装置の説明書をみれば、単位面積あたりどのくらいの電流値がよいかのっているとおもうので、それをもとにゲル面積から計算してみれば必要な転写条件が分かるでしょう。もしもその辺を変えても改善されなければ転写装置自体の故障とおもいます。炭素電極板などでは長く使っているうちに変形して転写効率が低下してきます。ステンレス製なら起こりにくいと思いますが。 X線フィルムに現像して、そのあと終わった後の膜をCBBで染めて両者（膜とフィルム）を重ね合わせてみてはどうですか。少し長く現像すると薄くバックがでてきますから、それを指標にしてうまく重ねあわせられるとおもいます。暗室と赤い安全ライトさえあればお金かからないし、結果もきれいで、一番確実なマッチング法と思います。

有難うございました 削除/引用 No.4365-3 - 2007/06/20 (水) 16:28:36 - V4 MMさんアドバイス有難うございます｡ いろんな本読んだんですが、MMさんが仰るようにメタノールの除去は、メタノールにより溶解性が限定された高分子の転写効率を上げるみたいですね。 その一方で、メタノールは､タンパクからSDSを剥がし転写効率を上げる効果もあるみたいですが。一長一短ですね。 一応書き込みの後、不連続系のバッファーでおこなって見たんですが、顕著な改善は認められませんでしたので、メタノールの濃度を下げたり、0.05％SDSの添加やタンク式で低電流、overnight転写するなど、試行錯誤してみます。

(無題) 削除/引用 No.4365-2 - 2007/06/16 (土) 12:09:11 - MM 転写効率を上げるには、まずは転写用のバッファからメタノールを除いてみることです。それでダメならタンク式の装置でバッファを冷却しつつ長時間転写します。

2次元電気泳動におけるPVDF膜への転写とスポットの同定法 削除/引用 No.4365-1 - 2007/06/06 (水) 11:54:20 - V4 ある雑多なタンパクを2次元電気泳動しPVDFに転写した後、血清中に含まれる抗体と反応するタンパクのスクリーニングの立ち上げを行っています。 そこで、以下の問題点がおこりました。 １）PVDFへの膜転写が芳しくない 下記の条件で行ったのですが、40kDa以下のマイナータンパクの転写は上手くいっていたのですが40kDa-90kDaのメジャータンパクおよび90kDa以上のタンパクの転写効率は50％程度でした。 実験条件 ゲル：12.5%(7x7cm) PVDF: Immobilin-P(ミリポア） 転写方法：セミドライ 200mA 1.5H 転写バッファー：20％メタノール Tris 25ｍM グリシン192ｍM 今後、１）アンペアを下げて泳動時間延長する２）陽極と陰極不連続なバッファー ３）0.1％SDSをバッファーに添加するなど 試みようと思うのですが、これをやったら上手くいったなどのアドバイスがあればお願いします。 ２）スポットの同定が困難 発色をimmobilin(ミリポア）によりおこないLASのケミルミで画像をとりこんでいます。しかしながら、HRP発色スポットがポンソー染色のスポットのどれにあたるのか同定するのが困難な状況です。 ケミルミでやった経験のある方がいらっしゃったら、どのような方法でスポットの同定を行っているのか教えてください。 それとも、膜を染めるDAB法がこの場合適しているのでしょうか？ ご存知ある方、アドバイス頂けたら幸いです。

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