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(無題) 削除/引用 No.4358-10 - 2007/06/12 (火) 03:07:42 - TK-1 何をしたいのか知りませんが、ただ何かをoverexpressionするだけであればretrovirusは使えないんですか？promoter/enhancer解析用のレポーターなら難しいでしょうが、ある遺伝子を導入したいのであればretrovirusでほぼ８０％以上の感染効率を得ることはそれほど難しくないと思いますが。 いずれのシステムを使うにせよ、所詮はoverexpressionですから、どうせならRNAiなどでloss-of-functionを使う系の方が結果の解釈に誤りは少ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4358-9 - 2007/06/11 (月) 21:28:31 - ひろ ヌクレオボンドのキットの精製度は塩化セシウムにはほど遠いです。昔私もヌクレオボンド使っていました。リポフェクション法ならよいのですが、EPでは難しいですね。私の経験上、その精製キットを使用する限りよいデータを得られるのは非常に難しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4358-8 - 2007/06/10 (日) 12:53:17 - Ｔ 文献は検索しましたか？結構色々な条件が使われていますよ。 http://scholar.google.com/scholar?hl=ja&lr=&q=k562+gene+pulser&btnG=検索&lr= しかし amaxa で50%程度なら、GenePulser でどれだけ最適化しても飛躍的に導入効率を上げるのは難しいのでは？ それよりも GFP を同時に入れて、陽性細胞をFACSで分取して解析した方がいいかも。

(無題) 削除/引用 No.4358-7 - 2007/06/10 (日) 11:09:33 - じゅんじゅん 　現在は、エレクトロポレーションの導入効率を上げなければ、トランジェントの実験系に移り変われない状態であります。今までは、クローンを作製してからフェノタイプを確認しておりましたが、クローン間にも差が大きく出てしまし、あと時間的なものを考えると、トランジェントと系で実験を進めていきたいと思っております。 　これまでに、エレポレでの導入はほとんどやっておらず、接着系の細胞時にはいつもはリポフフェクションでやっておりました。今回、初めて浮遊系での実験を進めており、エレポレの経験が少ない私には効率を上げるにはどこを改善すればよいのかまったくわからない状態です。 　トランジェントの系が確立できれば、一気に実験も進めていけるのですが・・・いまだ足踏み状態。。。 　とりあえず、もういちどGFPを使って導入効率を検討するとこから始めたいと思います。エレポレ後、すぐに37度にもっていって見ます。 　どうしてもうまくいかなければ、またアドバイスお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4358-6 - 2007/06/09 (土) 20:44:41 - 〜 K562は使ったことがありません エレクトロポレーションはキュベットのメーカーが変わるだけでも 、条件が変わります パルスは古典的なポレーションよりも高生存率、高導入効率が期待されていますが、 周りではうまくいっている人を見た事がありません (機械の名前にはパルスが付いていますが、条件にパルスが入っていないようにみえますが、どういう条件なのですか？) ベックスから購入した機材で、条件検討して、 修士課程の院生さんが1月位でそれなりの条件を作っていました じゅんじゅんさんならば、半月位で条件を作れるのではないでしょうか とりあえず、私ならポレーション後はすぐに37度に戻します

(無題) 削除/引用 No.4358-5 - 2007/06/09 (土) 20:33:56 - 〜 まずは1点確認させて頂きたいのですが、じゅんじゅんさんは次のどの状態でしょうか 1 質問をした日より前からポレーションの条件検討を進めていて、 明後日位にはphenotypeをみる時間の検討は終わるけど参考にするために他の人の条件も聞いてみたい 2 別にメインの実験があり、 これは片手間実験なので条件が決まるまでは実験しない 3 エレクトロポレーションの条件検討が、機械、キュベット、細胞によって変わることを知らず、 聞いた条件ならばそれでうまく入ると考えている 4 その他

(無題) 削除/引用 No.4358-4 - 2007/06/09 (土) 17:48:05 - じゅんじゅん ご返信、まことにありがとうございます。 現在、プラスミドの精製はヌクレオボンドのキットを用いてますが、精製度は塩化セシウムとほぼ同等の純度だと聞いております。また、amaxaの導入キットが購入できれば簡単に導入することが可能なのですが・・・予算的に古典的な導入方法で行うしかありません。 　 　古典的な導入方法と言いますと、BIO-RADのGene Puls装置を用いて行うことも当てはまりますか？もし、そうであれば、実際に50％のviabilityになる条件の目安を教えていただきたいのですがご存知でしょうか？ 　あと、マスカルチャーで実験を行う場合、phenotypeを観察するのに時間はどれくらい置いた後に観察すればよろしいでしょうか？いろいろと質問ばかり申しまして申し訳ありません。お時間に余裕がございますときにご返信よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4358-3 - 2007/06/06 (水) 11:52:49 - ひろ 今までの経験上プラスミドの精製度がかなり影響すると思われます。 塩化セシウムで精製していますか？？ 純度を上げれば５０%以上は入りますよ！ ちなみにK562にAmaxaでエレクトロポレーションしたときは50%以上導入できました。 DNAをメーカー推称のkitを使用した場合は細胞も結構死にましたし、導入効率も半分くらいになりました。

(無題) 削除/引用 No.4358-2 - 2007/06/06 (水) 07:29:06 - 〜 ポレーション後のviabilityはどの位でしょうか。 古典的なエレクトロポレーションの場合は、viability50%を目安に条件設定しています。 15%入っているのでしたら、クローンを複数とって表現型をみたり、 マスカルチャーでセレクションして見ることは出来ませんか？

K562細胞への遺伝子導入について。 削除/引用 No.4358-1 - 2007/06/05 (火) 21:52:41 - じゅんじゅん 　はじめまして。 現在、K562細胞を用いて、ある遺伝子を導入して、そのphenotypeを観察しようと計画中でありましが、まず、ＧＦＰvectorを用いての導入効率をＦＡＣＳにて解析したのですが、予想以上に導入効率がよくありませんでした（約１５％程度）。そこで、エレクトロポレーション法にての導入効率をあげるにはどのような点に注意して実験を行えばよろしいのでしょうか？よろしくお願いいたします。 　エレクトロポレーションの条件は以下の通りです。 　細胞 2×10A6　に対し、vector10ug。 　細胞をカウント後、ＰＢＳで一回洗浄し、ＰＲＭＩ(FBS-）290ulで細胞をサスペンド。その後、GFPvector10ul(1ug/ul)を加え、すぐエレクトロポレーション（155V、1000uF、Resistance∞、cuvette4mm）。 　１５分、室温に静置して、ディッシュにPassage(medium:RPMI/FBS+)。２４〜４８時間で導入効率をFACSにて解析する。 上記の方法で間違い等ございましたら、ご指導の程よろしくお願いいたします。

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