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(無題) 削除/引用 No.4350-12 - 2007/06/11 (月) 09:19:46 - pirori ＞ＹＴさん 和光のアンモニア・テスト・キット、調べてみました。微量のアンモニア検出に適しているようですね、ありがとうございます。やっぱりpHやアンモニアでの定量というのが一番手っ取り早いですね。 ＞名無しさん 培養しているのはピロリ菌ではなく複数の生活環境菌なので、培地もごく一般的な栄養培地です。ので、培地等の影響は少ないかと思います。問題は、、ウレアーゼが菌のどの部分に存在してるかよくわからないところで、ピロリ菌は細胞表層にあるようですが、私の扱っている菌がどの部分にそれを保有しているのか、菌体外に分泌しているのかわかりません。菌体外がほとんどであれば、集菌して上清から測定すればよいし、菌体内含めた測定が必要であれば膜を壊す必要が出てきますよね。ウレアーゼの有無ではなく、定量をしたいので、そこらへんが正確にできるかどうか少し不安です。。貴重な御意見ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.4350-11 - 2007/06/09 (土) 13:29:11 - 名無し 話の内容から察すると培養しているのはもしかピロリ菌とかですかもしそうなら培地に馬かウシの血清入れてるかもしれないのでそんなすごいたくさんのきょう雑蛋白質あるなかでそこから酵素分離したりとかクルードで酵素活性測るのはのはちょっとやっかいかなあとかおもったけどそのへんはだいじょうぶですか。あと昔がっこで習った記憶だけどウレアーゼは菌が分泌しているというよりたしか菌体の外側あたりにあるのが菌体からはずれて漏れ出てきているというのが正確ではとおもうのでたとえば集菌してPBSかなにかにけんだくして何回かボルテクスするだけでもけっこう取れてくるとおもうけどそれじゃだめですか。

(無題) 削除/引用 No.4350-10 - 2007/06/07 (木) 13:53:40 - YT urease活性の測定はﾁｮｯﾄだけ調べた範囲ではｱﾝﾓﾆｱ濃度測定でみてるとこも多いみたいですね。 　 和光純薬のｱﾝﾓﾆｱﾃｽﾄ・ｷｯﾄが良く使われてるようです。 ま、どこのでも良いのでしょうが。ﾁｮｯﾄした血液性化学検査でも項目にありますし、測定法は難しいものではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4350-9 - 2007/06/07 (木) 09:04:14 - pirori 昨日不在で返信が遅くなりました、みなさん たくさんの御意見をありがとうございます。 ＞名無しさん 硫酸アンモニウムは初心者にも比較的簡単な操作で蛋白質回収できる方法のようですね。変性も収率のロスもなしで回収できるのはかなり魅力的ですね。 ＞ＹＴさん ウェスタンで定量というのは、シグナルの強さを画像解析等で評価するということになるのでしょうか？知識不足ですみません、、サザンはやったことがあるのですが、数と位置決めにしか使ったことがないのでどういう定量方法になるのかよくわかりません、、活性じゃなく量の定量でも構わないです。 ＞通りがかりさん 私が定量したい酵素はウレアーゼで、調べた感じではpHで判定する方法が主なもののようです。同様の活性があるものであればアイソザイムも含めトータルの反応を定量したい（自然な加水分解の影響は抑えたいですが・・）です。 蛋白質の基本的な知識が不足してますね、みなさんの御意見を聞いてもうちょっと色々調べて取り掛からなければダメだと思いました。頂いた提案から順に詳しく調べてみたいと思います。貴重な御意見をたくさんありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.4350-8 - 2007/06/06 (水) 19:20:11 - 通りがかり ＞piroriさん タンパク質の解析は、種類によってかなり変わりますよ。 酵素の精製タイミング、精製方法、収率、酵素の安定性、活性定量系の確立、アイソザイムの有無など解決すべき点は多くありますよね。 酵素にもよりますが、基質の種類、温度、pHや塩濃度、補因子の有無などの変化で、活性がダイナミックに変化するものは多いです。 まず、piroriさんの書ける範囲で定量したい酵素について情報を書かれた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.4350-7 - 2007/06/06 (水) 12:03:31 - YT 普通は基質や生成物の時間当たりの変化から酵素活性は測るのでしょうが、それらを測定する簡便な方法が無いのだとすれば、陰性・陽性を判定できるｷｯﾄがあるのならサンプルを段階希釈して半定量するのはどうでしょうか？ 　 そもそも、既に指摘されているように、精製したからと言って正確な「活性」の定量が出来るわけではないし、「活性」でなくて「量」から活性を推定するのならばWesternで酵素「量」を比較するのが一番てっとり早いと思います。

硫安どうでしょう。 削除/引用 No.4350-6 - 2007/06/06 (水) 11:12:47 - 名無し 無血清培地にして１日くらい培養してから培地集めて細胞のかすを遠心で除いてから上清とってそこに硫酸アンモニウム（硫安）の粉をバッと入れて低温で１晩くらいおいて蛋白質沈殿させて（培地の蛋白質濃度すごい薄いからちゃんと沈殿できるまでかなり時間掛かる）遠心して沈殿集めて少量の適当なバッファに沈殿を懸濁してそれを大量の適当なバッファに透析して硫安濃度下げて再可溶化して実験使ってた。硫安は蛋白質を変性させずに沈殿さすことができるしカラムみたく吸着ロスとかないし硫安自体蛋白質を安定化（保護）する働きもあるしすごいいいとおもう。まわりにいた、CMにでてくる分泌蛋白質を調べたり精製したりしてる人はみんなそうやってた。

(無題) 削除/引用 No.4350-5 - 2007/06/05 (火) 18:58:46 - pirori 今回の質問では、培養液からの一般的な酵素定量方法を 伺いたかったのですが、実験としては 培養液中の全酵素（菌体内＋外）と菌体内酵素をそれぞれ 定量して差を求めることを考えています。 キットがあれば楽ですが、 ・酵素活性を維持したまま細胞から全量抽出する方法 ・細胞外酵素のみ収集する方法 がわかれば助かります。 酵素の種類によってもかなり変わってくるものですか？

(無題) 削除/引用 No.4350-4 - 2007/06/05 (火) 17:50:30 - 〜 分離と精製をどのように使い分けているのでしょうか？ 質問文を読む限りでは、聞きたいのは 「○○の酵素活性を定量できるキット（又は方法）はなんですか？」 だと思うのですが、違いますか？

(無題) 削除/引用 No.4350-3 - 2007/06/05 (火) 17:33:32 - pirori 早速ご教授下さりありがとうございます。 特に培養液中に取り除きたいものがあるわけではないので、 純粋に酵素活性が定量できれば構いません。 ですので、酵素を精製する必要はないかと思われます。 活性の定量方法を調べていたのですが、市販されている キットでは活性有り・無し判定するものがほとんどで 活性の定量を行えるものが見当たりません。 酵素活性の測定では、反応によって生じる二次産物の 定量で活性を定量するのが一般的と考えてよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4350-2 - 2007/06/05 (火) 16:50:07 - 〜 酵素活性の評価ならば、精製はしなくてもいい場合もありますが、 そのまま活性を測定することはできないのでしょうか。 精製はどうしてもロスが出ますし、 その間に活性が落ちる可能性もあります。 酵素を培養上清中の何かから分離しないといけないのでしたら、 分離する対象を明確にしたほうが、より具体的な回答が得られるかと思います。 例えば、 ゲルろ過 イオンクロマトカラム アフィニティーカラム などは、酵素活性を失わないまま精製できる場合があります。 タンパク質以外を除きたいのでしたら、 透析 限外ろ過 なども候補に挙がります。

培養液から酵素を分離する方法 削除/引用 No.4350-1 - 2007/06/05 (火) 15:50:12 - pirori 細胞外分泌酵素を培養液から分離したいです。 遠心分離などが考えられますが、他に酵素を 変性させずに分離する方法があればどなたか教えて下さい。 定性的な分析ではなく、 酵素を全量抽出し酵素活性を定量的に評価したいです。 酵素初心者のため初歩的な質問ですみません。

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