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コロニーPCRで 削除/引用 No.4340-7 - 2007/06/05 (火) 12:11:42 - HT TAクローニングで一方向のクローンが欲しい場合は、どちらか一方のプライマーをベクター上の配列に、もう一方をインサート上の配列にして、コロニーPCRで区別しています。方向があっているかどうかしか解らないので、最終的にはプラスミドをとってシークエンスで確認します。方向を決めてクローニング出来るタイプのキットは高価なので貧乏研究者の自分には購入できません。 コロニーPCRの産物を直接シークエンスを行っている方も居るようですが、どうなんでしょう。私は心配なのでプラスミド抽出を行いますが。

すいません・・・ 削除/引用 No.4340-6 - 2007/06/04 (月) 21:15:13 - そば 私が読み違えました・・・

(無題) 削除/引用 No.4340-5 - 2007/06/04 (月) 20:25:27 - Ｔ TOPO 発現ベクターというものも多数売られています。 https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=viewCatalog.viewProductDetails&productDescription=764& このベクターの多くは TOPO TA システムを用いたもので、これは ligase でなく topoisomerase を使っていますが、つなぎ方自体は TA クローニングと同じです。当然インサートはどちらの方向にも入り得ます。 こういうものを使った場合、コロニーを幾つか拾って当たりの方向のインサートを選び出す事になります。

(無題) 削除/引用 No.4340-4 - 2007/06/04 (月) 18:32:01 - そば 質問者さんの聞いたキットというのはTA cloningキットではなく、TOPO cloningキットなのではないでしょうか？ http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/K4900-01_001.shtml TA cloningをするキットも似た名称で販売されているので混同されたのではないかと思いますが、正確に言えば”TA cloning”ではありません。 どのように方向性を決めているかは、取説の英語を読むか、カタログの日本語解説を読めば分かると思います。 （申し訳ありませんが、直接回答をするよりは自分で調べた方が勉強になると思いますので・・・。ご理解下さい）

(無題) 削除/引用 No.4340-2 - 2007/06/04 (月) 14:58:35 - 〜 発現ベクターに発現させる遺伝子のORFをTAクローニングで入れることはあまり多くは無いと思います。 １．可能であれば、2種類の制限酵素で向きを決めてクローニングする ２．向きが決められないクローニング(TA、ブラントエンド、1種類の制限酵素処理)でも、 複数クローンを取れば、当りの向きは取れる場合がほとんどです。 ミニプレップ→制限酵素処理 PCR などで、向きを確認することができます。

プラスミドを大腸菌で 削除/引用 No.4340-1 - 2007/06/04 (月) 14:11:08 - ジロー プラスミドを大腸菌で増やすときにTAクローニング法が使われますが、発現ベクターにＤＮＡを組み込む時もTAクローニングが使われていると聞きました。インサートの向きはTAクローニングでは決められないイメージがあるのですが、発現ベクターにインサートを入れるとき向きはどのように決めているのでしょうか？

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