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なるほど。 削除/引用 No.4337-7 - 2007/06/05 (火) 00:07:00 - なるほど。 そば様返信ありがとうございます。なるほど！と目からうろこです。 新たにプライマーを作る際にはPrimer3でTm値を最初から60度以上で 設定しているのですが、問題のプライマーはもともとreal time PCR用に 作っていないもので、大量にいろいろストックしている中からchoiceして 使っていました。sizeは200bp前後でしたが、アニーリング温度が、 F:58.6度、R:56.7度でした。おっしゃるようにプロトコールの標準的な 60度ではうまくアニールできてなかったのかもしれません。 アニーリング温度を下げてre-tryしてみます。ご丁寧にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4337-5 - 2007/06/04 (月) 21:46:43 - そば データを見てない以上断定は出来ませんが、おっしゃる通り増幅効率が悪いという事になるかと思います。 増幅断片は150bp以下ですよね？ もしそうであれば、反応条件が悪い可能性が高いのでアニーリング温度を下げ、再度検量線を引いてみるという方針になるかと思います。 ちなみに私もPrimer3で設計していますが、Tmを60℃、増幅断片を150bp以下（最近は100bp以下にすることも）に設定してプライマーを設計します。 最終濃度50nMの各primerでアニーリング温度55℃でまずは実験を開始しています。 主に使っている試薬はQIAGENのSYBRですけど、この条件で大体うまく行っています。ご参考までに。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4337-4 - 2007/06/04 (月) 20:02:31 - ありがとうございます。 GOOGLE様、そば様ありがとうございます。 早速検索databaseを見に行きました。あとはその論文の詳細を読んで、 熟考したいと思います。 また今のところ、TAKARAとABIのSYBR Greenを中心に使っていますが、 確かにプライマーの最終濃度は濃かったです。ABIの人に300nMぐらいで 最初お願いしますといわれたのから、あまり調整していませんでした。 作成する予定のプライマーで、たとえdimerができても濃度調整でまず、 対応してみようと思います。 もしご存知でしたらでいいんですが、dimerとはちょっと違うのですが、SYBR Green(TAKARAもABIも)でPCRして検量線を描いたのですが、 correlationは0.994ぐらいなのですが、slopeが-4.5とかになってしまい ます。melting curveはpeakがひとつで美しいのですが、slopeがうまく 書けない原因がよく分かりません。 検量線は1/5希釈で５点取っています。うまく増幅できてないのでしょうか？ もし何らかの考えられる可能性がありそうなら教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4337-3 - 2007/06/04 (月) 18:22:47 - そば 直接的な回答は他の方がしていますが。 dimerが出来るかどうかはプライマーの配列や精製度も重要ですが、プライマー濃度も重要です。どんな優秀なプライマーでも濃度が高ければdimerが形成されやすくなります。 ABIのSYBR Greenを用いたRT-PCRキットでは、標準的なプライマー最終濃度として50nMという数値が挙げられています。通常のPCR反応に比べて薄い濃度ですよね。 プライマー濃度を下げてdimer形成がかなり抑えられた経験もありますし、プライマー濃度を振ってみることをお薦めします。

"rtpcr primer database" 削除/引用 No.4337-2 - 2007/06/04 (月) 17:52:55 - GOOGLE http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/

real time PCRの論文で使われてるプライマーは？ 削除/引用 No.4337-1 - 2007/06/04 (月) 04:27:17 - ご存じないですか？ 最近眠っていたreal time PCRを立ち上げ、SYBR Greenによる定量を 中心に行っています。Primer3でプライマーを設計しているのですが、 なかなかdimerを作らないプライマーの設定は難しいです。 そこで質問なのですが、膨大にある論文の中から、実際にreal time PCRに 使っているプライマーセットを検索できるソフトなどのツールを ご存じないですか？もしご存知でしたら教えてください。

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