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(無題) 削除/引用 No.4334-11 - 2007/06/06 (水) 00:52:59 - YT Maybe, you have not got the point. What is your goal? Do you want to get a cell line which persistently express a ceratin protein? If so, you should use expression vectors with a gene for selection such as "neo". If you want to do luciferase assay where you determine activities of a certain fragment of genome as a promoter or enhancer in the cell line, you should not make stable transformers because integration of the fragment in the cell's genome might place it under influence of various kinds of promoters, enhancers and epigenetic factors, making interpretation of the results very difficult, as 通りすがり-san says.

(無題) 削除/引用 No.4334-10 - 2007/06/05 (火) 19:18:53 - しゅ YTさん、通りすがりさん、ありがとうございます。 stableをとったとしても、挿入部位が異なるために結果の解釈がしにくくなってしまうのですね。勉強になります。 CT26はHelaに比べれば増殖速度や導入効率は落ちますが、極端に悪いというわけではありません。 今回の実験をする上で「安定して光り続けること」というのが不可欠となってしまったのですが、lipofectamine2000で数回試したのですがstableなものが得られませんでした。 やはり、安定株を得る場合にはウィルスベクターを用いたほうがよいのですね。ちなみに、ウィルスベクターを作成するに当り、お勧めのkitがありましたら教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4334-9 - 2007/06/05 (火) 07:59:23 - 通りすがり YTさんのおっしゃるとおり通常のreporter assayなどが目的なら stableをとる必要はありません。 実験にもよりきりですがほとんどの場合trasnfectして 24~72時間以内ぐらいに検出することが多いと思いますが。 だいたいどんな細胞でも96~120時間ぐらいから 外来性に導入した遺伝子の発現は全般的に激減します。 そこから非相同組み換えで10^-3ぐらいの割合でゲノムのどっかに挿入されるため目的に応じてstableなどをとりますがこの際哺乳類用のselectionのcasetteがvectorに含まれてない限り通常はcloneを見つけるのは難しいです。 GFPとかならFACSでできますがluciferase単独ではちょっと無理です。 CT26というのは使ったことがないですが ひょっとして増殖速度や導入効率などが極端に悪い細胞なのでしょうか？ あと、stableをとってしまうと、 挿入されたlocusのクロマチン状態などが、 転写のbasalな値に影響してくるので Cre-loxP配列などが吹かされておりRCMVなどで常に同じ 挿入部位での比較などが可能なシステムを 持っていないのでない限り、 実験的に結果の解釈が不可能になるので避けたほうがよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4334-8 - 2007/06/05 (火) 05:37:03 - YT To be honest, I had not known those vectors and I had thought they would be some kinds of usual expression vectors. But, after reading that they do not have any gene for selection, I checked them out on websites of Promega. There, I found they are vectors for luciferase assays. You are goin to do luciferase assays, aren't you? In this case, you need not (or must not) make stable transformer. You have to complete your work when the cells are in transiently transfected states. If you need large number of cells to get lysates, you better culture cells on large vessels from the beginning and transfect them.

(無題) 削除/引用 No.4334-7 - 2007/06/04 (月) 20:20:15 - しゅ 〜さん、ありがどうございます。 トランジェントしたとしても、ステーブルなものはごくわずかなのですね。ということは、トランジェント後は数日間か置いてから発光確認などをおこなったほうがよいのでしょうか？ 薬剤耐性遺伝子はあるのですが、アンピシリンですのでCT26細胞には作用しないような気がします。ということは、クローニングを行って発光する細胞だけを選び出した方が良いのでしょうか？ 質問だらけでごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.4334-6 - 2007/06/04 (月) 16:12:11 - 〜 その細胞を使ったことがありませんが、 HeLa細胞の場合ではトランジェントで90%以上入っていても、 ステーブルに入るのは10^(-3~-5)位の頻度です。 ベクターに薬剤耐性遺伝子が入っているのでしたら、 100mmディッシュに継代する際に、2つ以上に分けて、 薬剤を入れてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4334-5 - 2007/06/04 (月) 13:17:53 - しゅ 〜さん、YTさん、返答ありがとうございます。 細胞は、CT26です。 遺伝子導入をLipofectamine2000で行った後、発光確認を行い、発光しているものを継代し35mmディッシュへ。その後、100mmディッシュに植え替えたので、継代は2回目行ったことになります。 はじめに発光確認をしてから、100mmディッシュで発光確認をするまでに10日間くらいかかっていると思います。 説明不十分でした。申し訳ありません･･･

(無題) 削除/引用 No.4334-4 - 2007/06/03 (日) 11:17:19 - YT なるほど、確かに細胞の種類とかが分からないとなんとも言えませんね。 つい自分が扱ってる細胞のつもりでLF2000だから80％くらいてのは翌日くらいだろう、植え替えて100mmで80％もせいぜい2日以内だろうと思いましたが、細胞によってはtransientが終わる頃になっててもおかしくないですね。

(無題) 削除/引用 No.4334-3 - 2007/06/03 (日) 08:02:43 - 〜 導入後の操作や細胞や薬剤耐性について書かれていませんが、 継代後の日数はどのくらい経っていて、 薬剤は入れているのでしょうか。 質問文をそのまま読むと、 35mmディッシュの時はトランジェントに発現していて、 100mmではトランジェントの発現が終わっているような気がします。 バルクででも、薬剤を入れておいて、 2~4回くらい継代すれば、 stableに導入された細胞が得られるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4334-2 - 2007/06/03 (日) 01:58:30 - YT I guess silencing of the CMV promoter is happening.

発光量の減少について 削除/引用 No.4334-1 - 2007/06/02 (土) 15:19:57 - しゅ 細胞へLipofectamine2000でプラスミドDNA(pGL3 control vector,pRL CMV vector)を導入した後、35mmディッシュにて80%程度まで増殖したところでルシフェリン･セレンテラジンをそれぞれ別個に加え、IVIS200を用いて発光を確認できたので、100mmディッシュへ継代を行いました。その後、80%程度まで増殖したところで、もう一度、同じ条件でIVIS200を用いた発光確認を行いましたが、100mmディッシュでの発光を確認することが出来ませんでした。 このように、発光が確認できなることはよくあることなのでしょうか？また、このようなときの対処法等ありますでしょうか？

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