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(無題) 削除/引用 No.4328-8 - 2007/06/02 (土) 18:49:42 - パンタ 皆様へ 質問者です。わかりやすく書こうと思ったのですが、逆に誤解を招くような表記になったことをお詫びします。簡潔に書くということの難しさを改めて学びました。 で、その簡潔に書いたのは、gene様の "10 kb vector + 3 kb insertと3 kb vector + 10 kb insertのほうが同じ13 kbなのに後者のほうが難しいようだが、何か理由があるだろうか、"に集約されています。（代弁していただきありがとうございます） これまでインサート、ベクターという言葉にだまされていただけで、勝手に間違ったイメージをしていたことに気づきました。 これをもって解決と致します。皆様、ありがとうございました。（パスワードを入れなかったために済マークはつけられませんが）

(無題) 削除/引用 No.4328-7 - 2007/06/02 (土) 17:44:08 - gene 質問を誤読しているかたがたがいらっしゃるようなので、あえて補足しますが、 10 kb vector + 3 kb insertと3 kb vector + 10 kb insertのほうが同じ13 kbなのに後者のほうが難しいようだが、何か理由があるだろうか、という質問でして。 コンストラクトのサイズが大きくなればなるほど、ligation/transformationが難しくなるのは問うまでもなく。 ただ、サイズが大きいほど複製に時間がかかるから、というのはこの場合あたらない、あるいは主な原因ではないと思います。サイズが大きくなるほど狙いのligation産物ができにくいということもさりながら、大きなコンストラクトほど大腸菌に入りにくいというのが一番効いてくると思います。クローニング済みで大腸菌から精製したplasmidでもサイズが大きくなるほど形質転換効率は落ちますから。

(無題) 削除/引用 No.4328-6 - 2007/06/02 (土) 17:24:12 - 中年 geneさんの仰るとおり、長いDNA断片は特にUVに感受性が高いと感じる経験がありました。そのため、BACなどから大きな断片をサブクローニングする場合には、クリスタル・バイオレットやナイル・ブルーなどの、可視光でDNAを確認できる染色液で切り出しを行っています。類似の市販品もあります。 http://www.mupid.com/staineye/index.html

(無題) 削除/引用 No.4328-5 - 2007/06/02 (土) 17:20:51 - D とても大きいInsertの場合は確実に難易度は上がると思います 慣れてコツが分かればそれほど難しくはないんですが 2kbpのvectorに20kbpのInsertとかやれば確実に慣れてないと苦労します Ligation反応液をイメージして 片側が結合されてもう片側もきちんと環状になるように出会う確率と 他のどうでも良いものと出会ってしまう確率を想像すれば効率に違いが出るのなんて明らかでしょう vectorがでかくなれば複製にも時間がかかるし 単なるAmpですらSOCでふらないと明らかに生存できないものが出てきます それにでかくて効率が落ちないならBAC用のSystemなんて必要無いということになるでしょう とはいえ今回の3kbに10kb程度なら少しコツをつかめば出来るようになると思います

(無題) 削除/引用 No.4328-4 - 2007/06/02 (土) 16:39:11 - パンタ gene様、バクテリ屋様、ご回答ありがとうございます。 どちらの方も、ligation効率には大差ない（UVによるダメージを無視した場合）とお考えのようですね。なるほど。 バクテリ屋様のおっしゃったようなことも考えられますが、今回想定していた、3000bpのベクターに10000bpのインサートを入れるときの2通りの方法での比較、という点では関係ないようです。説明不足でした。大変申し訳ございませんでした。 あまりこのような大きな断片を挿入することはないかもしれませんが、皆様は気にせず反応を行っていらっしゃるのでしょうか？　またその効率は、やはり大差ないのでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4328-3 - 2007/06/02 (土) 07:08:51 - バクテリ屋 大腸菌内での複製のステップをお忘れでは？ 試験管内でのligation反応では目的分子が形成されていても、外来DNAがベクターより大きすぎると宿主内で安定に複製されない場合が多いです。

(無題) 削除/引用 No.4328-2 - 2007/06/01 (金) 23:25:12 - gene ligationの難度に違いはないと思います。 ひとつ考えられることは、インサートの調製にアガロースゲルからの切り出しをして、ベクターのほうは制限酵素消化（プラス脱リン酸）だけだったとすると、長いインサートのほうがマトが大きい分だけ、UV照射によって一分子内のどこかにピリミジンダイマーができる確率が高い、ので形質転換効率が低くなるということはあります。

インサートとベクターの区別 削除/引用 No.4328-1 - 2007/06/01 (金) 21:58:51 - パンタ いつもお世話になっています。 さて、先日後輩と話をしていてふと思ったことを書きます。 ligationのとき、インサートが大きくなるほど難しくなることがあると思います。例えば3000bpのpUCに平滑で10000bpのインサートを入れようと思うと、一回で入れようとは思いません。 しかしながら、10000bpのベクターに3000bpのインサートを入れることは別に苦にならないと思います。 ここで、ベクター、インサートというのは我々が勝手に決めているだけであって、実際反応液中ではどちらの場合でも3000bpと10000bpのDNA断片が存在して、ligation反応をしているだけだと思います。なのに2つの場合でこんなにも印象（あるいは結果）が異なるのか？ 僕は何か大事なことを忘れているのでしょうか？　皆様はどう考えておられますか？ よろしくお願いします。

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