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(無題) 削除/引用 No.4326-3 - 2007/06/01 (金) 22:30:22 - 名無し PBSで希釈しているのはダメじゃないけどあんまりよくないというかPBS使う必要性がないと思います。それはPBSはカリウムがはいっているので、SDSと一緒になると沈殿するのでその分SDSの濃度が下がってしまうかもしれないからで、もう一つは、SDSで完全変性させておいて、一方でPBSを用いて生理的な条件を考慮したところであまり意味をなさないからです。 ゆえに水で希釈して構わないと思います。 buffer濃度やpH6.8は単に電気泳動の方の事情でそういうの使っているとういのが大きい。グリセロールも比重かけてサンプルが沈みやすいようにするためで、これも電気泳動のための事情。2%SDSは蛋白質の変性（プロテアーゼとかを一気に失活させてしまうという目的も含む）メルカプトエタノールは蛋白質分子内／分子間のダイサルフェイト結合などを還元して切る為に入れていて、これも蛋白質の変性が目的。ブロモフェノルブルーは単に電気泳動で蛋白質の先端がどこまで流れてきたかを知る目印。こんなかで蛋白質定量で問題がおこるのはSDSとメルカプトエタノール。2%SDSはブラットフォールド法を妨害する。メルカプトエタノールはBCA法とかホーリンのローリー変法を妨害する。だからBCAで測るなら、蛋白質定量終わってから、メルカプトエタノール入れてる。

(無題) 削除/引用 No.4326-2 - 2007/06/01 (金) 20:15:55 - R SDS-PAGEの基本事項ですね。 以下を参照してください。 http://mullinslab.ucsf.edu/protocols/html/SDS_PAGE_protocol.htm

タンパク抽出について 削除/引用 No.4326-1 - 2007/06/01 (金) 20:05:40 - 無 現在、COS-7細胞をTransfection後に5×sample bufferを用いてタンパク抽出をしています。sample bufferの組成は500mM Tris-HCl pH 6.8、50％ glycerol、10% SDS、25% β-mercaptoethanol、1% bromophenol blueです。このsample bufferをPBSで５倍希釈して行っているのですが、それぞれの試薬が何のために含まれているのかわかりません。タンパク定量のために後から加える必要のあるものもあるので、できれば何のために含まれているのか知りたいのですが、どなたかアドバイスをいただけないでしょうか？

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