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PCR産物のシークエンス トピック削除
No.4313-TOPIC - 2007/05/31 (木) 08:38:21 - Taka
初歩的な質問で恐縮です。

PCR産物のシークエンスがうまく行きません。
ゲル抽したのもカラムでPCR産物を精製したのも、結果は惨憺たるものです。
仕方がないのでｐGEM-Tにクローニングしてプラスミドから読んでいますが、手間がかかります。

どなたか、うまくいくコツを少し教えてください。
ちなみにシークエンスは基本的に反応から外注していますが、BDでの反応を自分でやることも可能です。

よろしくご指導願います。
　
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sequence primer 削除/引用
No.4313-6 - 2007/06/10 (日) 00:22:16 - 370A
私の経験だと、シーケンスプライマーの配列で結果が大分変わる事があります。又はＰＣＲプライマーの5’端にプラスミド用のシーケンスプライマーをつけるのもよく聞く方法のひとつです。ただし私の場合ＰＣＲプライマーとの相性が悪かったらしく上手く増幅出来ませんでした。

鋳型を１本鎖ＤＮＡにすると感度と精度が大幅に向上します。私がやっていた頃はファージを使っていましたが、今ではビオチンーアビジンカラムやヌクレアーゼなどを使ってＰＣＲ産物からダイレクトに一本鎖ＤＮＡを作れるようです。昔の事なので今は違うかも知れませんが、クローニングして繰り返し配列を読んだ際はサイクルシーケンスもうまくできなかったような気がします。プライマーと鋳型の比率もいじったほうがいいかもしれません。一度、ダイレクトシーケンスの条件決めの実験をしたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.4313-5 - 2007/06/07 (木) 19:05:13 - kawa
プライマーはPCRのものとは別にしたほうがベースラインは落ちることが多いようです。Exosapは確かに便利です。うちではPCRをプレートでかけて、ローディングダイを加えてプレート遠心機で落としてプレートミキサーで混合後にマルチチャンネルピペットで泳動して増幅をチェックし、残りをExosap処理してシーケンス反応かけていますが問題なく読めます。たくさん読むときは便利ですよ。ちなみにローディングダイはTOYOBOのものを愛用してます。またExosapは前の人の紹介のページにもあったように、かなりケチっても問題ありません。その場合は一応反応時間を延ばしています。

(無題) 削除/引用
No.4313-4 - 2007/06/01 (金) 05:55:35 - Gill
このページを参考にPCRダイレクトシークエンスをしたことがあります。
http://cse.fra.affrc.go.jp/ksaitoh/PCRseq.html
ExoSapIt という試薬を使うのでゲル濾過とかしなくてすむので楽ですよ。

ちなみにPCRプライマーとシーケンスプライマーは同じものでも読めました。（別のものが使えるのならその方がいいと思いますが）

(無題) 削除/引用
No.4313-3 - 2007/05/31 (木) 09:06:28 - う〜んと
最近やってませんが、コロニーダイレクトPCRからゲルろ過して100倍くらいに希釈すれば読めてましたよ。
確信はありませんが、PCRプライマーとシーケンスプライマーは違う配列にするほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.4313-2 - 2007/05/31 (木) 09:02:06 - acb
PCR産物は、シングルバンドで増えていますか？

目的のバンドと同じサイズの非特異的なバンドが増幅していた場合、アガロースゲル電気泳動では分離できないので、いくらゲル抽やカラム精製してもダイレクトシークエンスできません。読み始めからシークエンスの波形が重なって出てきます。

また、増幅配列中に極端に長い単純な繰り返し配列がある場合も、PCRのスリップが起こり、シングルに見えているバンドの中に、いろいろな繰り返し数のDNAが混在することになります。この場合、繰り返し配列以降の波形が乱れます。

上の2点は、Takaさんがやられたように、クローニングすることで回避できます。

「PCR産物のシークエンスがうまく行きません。」とは、どのような症状なのでしょうか？

PCR産物のシークエンス 削除/引用
No.4313-1 - 2007/05/31 (木) 08:38:21 - Taka
初歩的な質問で恐縮です。

PCR産物のシークエンスがうまく行きません。
ゲル抽したのもカラムでPCR産物を精製したのも、結果は惨憺たるものです。
仕方がないのでｐGEM-Tにクローニングしてプラスミドから読んでいますが、手間がかかります。

どなたか、うまくいくコツを少し教えてください。
ちなみにシークエンスは基本的に反応から外注していますが、BDでの反応を自分でやることも可能です。

よろしくご指導願います。
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