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発現が確認できました。 削除/引用 No.4310-10 - 2007/06/29 (金) 13:53:40 - ii-Yeast East様 お久しぶりです。ご連絡が遅くなってすみません。 あれから、ちょっと実験をつめることができなかったのですが、久しぶりに、誘導をかけてみました。教えて頂いたように、ラフィノースで前培養をしてから、誘導をかけたら、４時間目あたりから、発現が確認できました。ウエスタンで見る限り、発現vectorをいれていない酵母では誘導がかかっていなかったので、明るい兆しがみえました。 有り難うございました！ また宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4310-8 - 2007/05/31 (木) 16:30:09 - East ラフィノースはグルコースと違ってGAL1プロモーターを積極的に抑制する作用はないので、グルコース培養時に比べれば転写が漏れ出る可能性はあります。ただし、今回の場合はガラクトース培養時ですら発現が確認されないのですから、ラフィノース培養時のわずかな発現は無視して良いのではないでしょうか。 CUP1プロモーターによる発現レベルが１倍体＞２倍体だったということについては、これまで自分で確かめたことがありませんし、初耳です。申しわけありませんが理由は分かりません。

有り難うございました−2 削除/引用 No.4310-7 - 2007/05/31 (木) 15:29:47 - ii-Yeast East様 お返事　有り難うございました。 説明不足ですみません。Cup1で発現させたタンパクは、CEN6/ARSを使いました。30μgを使ってウエスタンをしたのですが、2倍体の細胞にいれたものではバンドはうっすらでした。GAL1では全くバンドが検出されなかったという状況です。 誘導をかけるまでは、しっかり発現を押さえておきたいので、初めグルコースを使いたいのですが、ラフィノースでの発現はどうなのでしょうか。 もうひとつわからないのが、Cup1では1倍体にいれたものでは、2倍体より数十倍以上の発現が検出されました。一応、Cuの濃度を3桁ふって、試しましたが、どれも同じでした。1倍体は2倍体の片方の酵母を使っています。よくあることなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4310-6 - 2007/05/31 (木) 10:45:08 - East 既にいろいろとコントロールとなる知見があったのですね。失礼しました。 CUP1プロモーターとGAL1プロモーターだと、GAL1プロモーターの方が強力であると思います。CUP1プロモーターのベクターもCEN/ARSタイプでしょうか。 ２μmのベクターでも安定に保持はされます（もちろん選択を掛けていればほぼ１００％）。ただし、細胞毎にコピー数のバラツキが出ますので、発現量の多い細胞と少ない細胞との混合状態になる可能性があります。 グルコースの持ち込みでしばらくGAL1プロモーターの誘導が遅れる場合もあり得ますので、下に書いたように発現するタンパク質の毒性がなさそうなのであれば、最初からガラクトース培地に薄く植えて培養してみることをお勧めします。毒性があるようでしたら、前培養をグルコース培地ではなくラフィノースのようなGAL1プロモーターを抑制しないような培地で行い、そこにガラクトースを加えることで誘導を開始するという方法もあります。

ありがとうございました。 削除/引用 No.4310-5 - 2007/05/30 (水) 21:57:59 - ii-Yeast East様 早速のお返事を有り難うございました。 CupIプロモーターで目的タンパク質を同様に発現させており、それとの比較でGAL1プロモーターによる発現をみていましたので、確かにCup1での発現量とはかなり差があるのかもしれませんね。 なるべく、分裂後にどの細胞にも発現vectorを含んでいて欲しかったので、コピー数の少ないけれど安定なCEN6/ARSを選びました。2μori でも結構維持されるのでしょうか。 プロテアーゼインヒビターを加えたY-PER(PIACE)を使っていますが、Cup1プロモーターの方で発現が確認できたので、時間はそれほど、気にしていませんでした。しかし、発現が弱いとなると、もっと気にしなくてはいけないですね。 有り難うございました。教えてくださったことを取り入れて、もう一度トライしてみます。 また、どうぞ宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4310-4 - 2007/05/30 (水) 21:35:00 - East 大事なことを忘れていました。酵母は液胞内プロテアーゼの活性が高いので、タンパク質分解には用心が必要です。 glass beadsなどでlysateを調製しておられるなら、プロテアーゼインヒビターを十分に加え、さらに細胞破砕中に温度が上がらないようにすることに留意すべきです。 菌体を直接１ｘSDSバッファーに懸濁して煮沸することでサンプルを調製しておられるなら、懸濁後、速やかに煮沸する必要があります。私は10秒以内を目安にしています。

(無題) 削除/引用 No.4310-2 - 2007/05/30 (水) 21:22:32 - East 単に発現レベルが低くて検出感度以下であったということではないでしょうか。 ２％ガラクトースを含む選択培地プレート上で空ベクターを含む形質転換体との間でコロニー生育に差がないのであれば、発現に伴う酵母生育への影響は無視できると思われます。そのような場合には、最初から２％（あるいは４％）ガラクトースを含む選択培地で培養し続けることで発現レベルの改善が見られるかも知れません。 さらに発現量を上げようとするなら、高コピー数ベクターを使うことをお勧めします。

発現プロモーター 削除/引用 No.4310-1 - 2007/05/30 (水) 20:51:09 - ii-Yeast はじめてメールします。宜しくお願いします。 　pYC2/CTというvectorのGAL1 プロモーターをつかって、発現させたのですが、上手くいきません。マルチクローニングサイトにATGつきの目的遺伝子をいれ、ATGの上流3bpにはAをおきました。誘導は2％グルコースで培養後、2％ガラクトースに変えて4時間おこないました。ウエスタンで発現を確かめたのですが、目的のタンパクのバンドがでてきません。何がいけないのでしょうか。どなたか教えていただけませんか。

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