BioTechnicalフォーラム [MG132の添加時間]

MG132の添加時間

No.4306-TOPIC - 2007/05/30 (水) 14:11:31 - 無

現在、MG132（プロテアーゼ阻害剤）を用いたwestern blotで実験を行っています。論文などではTransfectionを24hr行ってからMG132を添加→6～10hr後にタンパク抽出するといった実験例が多いのですが、これではTransfection時間が24hrを超過してしまうことになりますよね？仮にTransfection時間を24hrに統一したい場合に、Transfectionが24hr経っていない状態でMG132を添加するとTransfectionに影響が出るということなのでしょうか？どなたかアドバイスをお願いします。
　

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No.4306-5 - 2007/06/03 (日) 15:18:22 - 名無し

ウエスタンしてるとかいてあるから、たぶん抗体持ってるっぽいから、一度タイムコースやって、何時間くらいで経つと発現がみられて、どのくらいそのレベルが維持されるか調べればその心配はすぐ解決すると思う。つまり２４時間プラスMG132入れてる時間の時にその蛋白質の発現が続いていることがわかればそれでOK.　
たまにトランスフェクションとかもするけど、仮に２４時間で発現がピークにあったものが、そのあと6～１０時間でなくなるということは絶対ないかといわれると困るけどけどそれに近いくらいないとおもう。ただプロテアソーム系で壊されるやつは比較的短寿命の蛋白質が多いから6～10時間でも変化みれるとおもうけどもしかしてターンオーバーの遅い蛋白質だとしたらそのくらいの時間だとまだ変化みえないかもしれない。プロテアソームあんまり長い事止めてるとそれで細胞もいろいろダメージきてその２次的な変化とかも出てきて結果の解釈が難しくなるときがある。MG132でいけたら高いけどラクタシスチンもやったほうがいいというか投稿した時やれっていわれるときある。

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No.4306-4 - 2007/06/01 (金) 15:23:03 - YT

阻害剤を入れたものと入れないものを比べるんですよね？

そういう場合の通常の方法は　「ﾄﾗﾝｽﾌｪｸｼｮﾝ→24時間→片方に阻害剤添加もう片方は無し→両方を同じ時間培養→回収」　だと思うのですが。
　
ちなみに24時間に拘る必要は無いと思います。
普通は蛋白の発現レベルが最大に達するのに24時間くらいかかるということで、もしその前に十分な量の蛋白が発現するならばその前でも良いかと。
　

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No.4306-3 - 2007/06/01 (金) 11:25:18 - 無

アドバイスありがとうございます。MG132を添加せずにタンパク抽出→Western blotを行う場合とMG132添加時のタンパク抽出→Western blotの場合のTransfection時間をそろえたいのですが、Transfection時間を24hrとする場合、MG132添加の場合はTransfection→MG132添加→Ttansfection開始から24hr後にタンパク抽出とすべきなのか、Transfection→24hr→MG132添加→数時間後にタンパク抽出するのかが判断できずに困っています。MG132によりTransfection効率などに影響が出たりするのでしょうか？

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No.4306-2 - 2007/06/01 (金) 00:46:17 - つま

２４時間というのはあくまでも目安なのではないでしょうか。
個々のタンパク質によって発現量や毒性等も違うでしょうし。

系を統一しさえすればtransfection後24時間で
MG132(「proteasome」 inhibitor)を添加でもいいのでは。

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No.4306-1 - 2007/05/30 (水) 14:11:31 - 無

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