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RNAの抽出　260/230が低い理由 トピック削除
No.4302-TOPIC - 2007/05/29 (火) 20:30:55 - mochi
RNAlaterに浸しておいたマウスの肝臓15-20 mgを乳鉢ですりつぶし、1%2-ME加RLT buffer 600 ul に溶解後QIAshredder→RNeasy Mini kitという順を経てRNAを抽出しています。
プロトコール通りに作業を進めているのですが、260/230がサンプルによって2.0を下回る（1.0-1.6、ひどい場合には0.3というものもありました）ことがあります。
これは何が原因でしょうか。
260/230が低い理由として1.塩のコンタミ、2.開始時の組織量がよく挙げられておりますが、1.に関しては注意して作業はしていますし、2.についてはその可能性を考えて元々30mgから抽出していたのを減らして現在は検討していますが、変化は認められていません。
またこちらのフォーラムでOD測定時の希釈液に関するトピックを拝見し、もしやと思ってTEや1mM Na2HPO4水など試してみましたが、260/230には影響はありませんでした。
さらに糖の影響に関するコメントも拝見したので、easy kitのカラムに添加する時の試料のエタノール処理を70%から50%に変えてみたりもしたのですが、こちらも特に変化はありませんでした。

それ以外の情報として、260/280は2.1ときれいだとは思いますが、収量は0.5-2.5 ug/mg 組織とkitに記載している収量(4-6 ug/mg組織) に比べるといまいちな感じです。

以上につきまして、どなたか改善策をご教授いただけないでしょうか。何卒、よろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.4302-7 - 2007/05/31 (木) 01:55:57 - 7878

比較実験をしたことはないですが、グアニジン塩の残留はそのカオトロピック効果が災いして酵素を不安定にするので、やはりRT反応やPCRにも影響があるのではないかと思います。なるべく核酸の品質をそろえたいところですよね。

あと、RNAの収量が規定値より少ないのは、塩が残っていて溶出を妨げているからかもしれませんね。そういえば、クリーンアップキットのバッファーにも最初にフィルターに核酸を結合させるのにエタノールとカオトロピック剤を使っていると思う（未確認ですが）ので、場合によっては塩の除去が上手くいかないこともあるかもしれないですね。メーカーによってはメンブレンや洗浄液の組成・工程を工夫して260/230比を改善しているところもあるようです。その工夫を私も知りたいところですが・・・。

それから訂正なんですが、下に書いた「beta-MEやグアニジン〜」のくだりの「beta-ME」については、私の記憶と出典があいまいなので取り下げます。お騒がせしました。

(無題) 削除/引用
No.4302-6 - 2007/05/30 (水) 21:27:24 - mochi
質問者です。
7878様、ご回答いただき、ありがとうございました。
クリーンアップはご提示のキットとは異なりますが（Qiagenのクリーンアップのプロトコールにて）、一応やっています。
それでもやはり260/230は変化しませんでした。
サンプル間で260値はさほど大差ありませんが、230値がかなりぶれます。
グアニジン塩がコンタミすると逆転写効率が悪くなるといわれていますが、RT-PCRの結果にはどの程度影響するものなのでしょうか？

コンタミかな 削除/引用
No.4302-4 - 2007/05/29 (火) 23:56:56 - 7878

260/230 ratioが示すものは、主にbeta-MEかグアニジン塩酸塩のコンタミの程度を示すといわれています。私もプロトコルどおりに抽出しているつもりでも、どうしてもこの値が悪いときがあります。たまたま洗浄が不十分だったのだろうとは想像していますが、具体的にどこが悪いのかは私も知りたいです。

ただ、対策としてこんな時わたしは深く考えずにクリーンアップキットで処理してます。ZYMOのRNA clean-up kit -5なんかはお手軽で私はお勧めです。

RNAの抽出　260/230が低い理由 削除/引用
No.4302-1 - 2007/05/29 (火) 20:30:55 - mochi
RNAlaterに浸しておいたマウスの肝臓15-20 mgを乳鉢ですりつぶし、1%2-ME加RLT buffer 600 ul に溶解後QIAshredder→RNeasy Mini kitという順を経てRNAを抽出しています。
プロトコール通りに作業を進めているのですが、260/230がサンプルによって2.0を下回る（1.0-1.6、ひどい場合には0.3というものもありました）ことがあります。
これは何が原因でしょうか。
260/230が低い理由として1.塩のコンタミ、2.開始時の組織量がよく挙げられておりますが、1.に関しては注意して作業はしていますし、2.についてはその可能性を考えて元々30mgから抽出していたのを減らして現在は検討していますが、変化は認められていません。
またこちらのフォーラムでOD測定時の希釈液に関するトピックを拝見し、もしやと思ってTEや1mM Na2HPO4水など試してみましたが、260/230には影響はありませんでした。
さらに糖の影響に関するコメントも拝見したので、easy kitのカラムに添加する時の試料のエタノール処理を70%から50%に変えてみたりもしたのですが、こちらも特に変化はありませんでした。

それ以外の情報として、260/280は2.1ときれいだとは思いますが、収量は0.5-2.5 ug/mg 組織とkitに記載している収量(4-6 ug/mg組織) に比べるといまいちな感じです。

以上につきまして、どなたか改善策をご教授いただけないでしょうか。何卒、よろしくお願い致します。
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