基本的にB6でやろうがBalbでやろうがin vitroでTh2 conditionにすればIL-4は十分に検出できます。たしかに同じTh2 conditionでやればBalbのほうがIL-4+な細胞の割合、サイトカイン産生量が多かったりしますが、B6でTh2 conditionでやってTh1レスポンスが見えるということはありません。「どのぐらい低いのか？」という質問は抽象的すぎてちょっと答えづらいです。細胞の割合、サイトカイン産生量でみれば半分以下ということはないというぐらいでしょうか？ただサイトカインの産生量などはどうしても実験間で結構な差が出ますので、なんとも言えないというところでしょうか。
Th2 conditionはIL-4 5ng/ml anti-IFN-gamma 10mcg/mlぐらいでしょうか？
だとすればやっている条件でB6でも細胞内染色で30%以上はIL-4+に染まると思います。3日目に再刺激するより、4日目以降に再刺激する方がTh1/Th2を見るときのプロトコルとして一般的な感じはしますが。
細胞内染色は16時間ぐらいから48時間ぐらいが一番染まりがいいです（anti-CD3の場合）。染め方の善し悪しでFACSの結果はかなり変わりますのでここはいろいろやってみてベストな条件を自分で見つけてみてください。
サイトカイン産生をELISAで見るのならば2日目から3日目ぐらいの培養上清がいいでしょう。RTは再刺激直後じゃないければどこの時間帯でやっても出ると思います。3日目の再刺激だと細胞回収直前でもかなりIL-4を出していると思われるので、たぶん刺激前でも出ると思いますが。 |
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