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(無題) 削除/引用 No.4290-12 - 2007/06/03 (日) 08:28:57 - 通行人 細菌の場合なので、関係ないかもしれないですが。 ２本鎖環状DNAを遺伝子破壊などで染色体に組み込ませる場合には、１本鎖DNAや線状DNAにした方が組み込み効率が良いです。 これは、１本鎖DNAや線状DNAが、DnaAなどのDNA修復系酵素の良い基質になるためです。 DNA修復、組替え、複製に関与する酵素系は、それぞれ独立ではなく重複しています。

(無題) 削除/引用 No.4290-10 - 2007/05/31 (木) 16:41:58 - 通りすがり いや、違います。 ウイルスでLTRなどの場合は、ウイルス自身のintegraseと宿主側の因子などによるPIC形成を介したintegration反応によるもので、 通常の線状のvectorなどの場合は、非相同組み換えが主ですので。

インテグレーションの機構 削除/引用 No.4290-9 - 2007/05/31 (木) 15:04:02 - linear 初歩的な質問なのですが、線状ベクターが細胞の染色体DNAに組み込まれる機構というのは、ウイルス遺伝子が組み込まれるものと同じメカニズムなのでしょうか？Bostonさんの発言で思ったのですが。 ウイルス遺伝子などでは遺伝子DNA末端はLTRという特別な配列になっていると学んだのですが、末端がむき出しになっている線状化したベクター遺伝子でも同じインテグレショーン機構が働くのですか？

(無題) 削除/引用 No.4290-8 - 2007/05/30 (水) 22:34:57 - 〜 >ばしばし さん 下記の3倍くらいになったというのは、 Lipofectamine＋lipofectamine plus です。

(無題) 削除/引用 No.4290-7 - 2007/05/30 (水) 14:42:54 - ばしばし 線状化のほうが発言量が高まった方はどのようtransfection試薬を用いているのでしょうか？ 私はlipofectamineを用いているのですが、メーカーに問い合わせたところ、この試薬は環状plasmidにて最適化がされてるといわれました。 線状化のものと環状とで自分は比較したことが無いのですが、もしもlipofectamineで線状化plasmidにてtransfectionしたことのある方がいらっしゃったら経験談をお話いただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.4290-6 - 2007/05/28 (月) 09:49:06 - Boston 環状プラスミドを用いた場合、染色体に組み込まれる過程で切断されますが、その切断がレポーター遺伝子上で起こる場合があります。相同組換えではないですから。当然、レポーターとしては機能しなくなります。それを避ける意味で、予めレポーター活性に影響のないベクター側を切断して transfect するのだと思っていました。

感謝です 削除/引用 No.4290-5 - 2007/05/27 (日) 23:53:02 - linear 〜さん、いつも有難うございます。 結構エレポレでは一般的なのですね。色々と勉強になりました。 薬剤耐性株などの樹立などに積極的に使ってみようと思います。 ご教授、感謝致します。

(無題) 削除/引用 No.4290-4 - 2007/05/27 (日) 22:53:46 - 〜 エレクトロポレーションでは一般的ですが、 リポフェクション、リン酸カルシウム法でも効果があるようです ヌクレアーゼによる分解はあるかもしれません 結果として発現量が多くなる場合はありますが、 発現量を求めていないのならば、やる必要はありません

〜さん有難うございます 削除/引用 No.4290-3 - 2007/05/27 (日) 19:36:51 - linear 〜さん、回答して下さり感謝です。 なるほど、インテグレーションの効率なのですね。 このような線状化してやるやり方は一般的な方法で皆さんやられているのでしょうか？私はあまりやったことは無いのですが...。 初心者の私は、細胞内に入ったlinearなDNAが端から細胞質中のnucleaseで分解されるように考えてしまい、ちょっと怖い気がしますが、大丈夫なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4290-2 - 2007/05/27 (日) 19:11:09 - 〜 同じ量入れてクローンを10個以上拾って、 線状の方が3倍位発現量が高かったです 多分導入効率ではなくて、 インテグレーションの効率ではないかと思います

ベクターを線状にして導入？ 削除/引用 No.4290-1 - 2007/05/27 (日) 17:56:04 - linear ベクターの遺伝子導入に関してお訊きしたいことがあります。 哺乳動物細胞にpcDNAなどの環状遺伝子をtransfectionし導入する場合で、ベクターを制限酵素で一箇所で切断し、linearにしてから遺伝子導入する人が周りにいました。話を聞くと「この方が導入効率が良いから」との答えでした。 このように制限酵素切断して遺伝子導入するやり方と、環状のままでtransfectionをするやり方とで、導入効率でそんなに差が有るのでしょうか？ 同様な方法で遺伝子導入している方がおりましたら、お教え下さい。

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