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培養細胞への遺伝子導入 トピック削除
No.4288-TOPIC - 2007/05/27 (日) 08:36:16 - masa
現在、HepG2で試薬でプラスミドDNAを導入し一過性にタンパクを発現させようとしています。
これまでにinvitrogenやpromegaなどから発売されているlipofectamineやTfx-20など様々な試薬で試してみました。
しかしルシフェラーゼアッセイでは活性があるのに対し、western blottingでタンパクの確認をすると全くバンドが認められません。
同様の操作でHEK293に発現させるとWBでタンパクは確認できました。
HepG2でWBでバンドを出すためにはどうしたらよいでしょうか？
初心者です。どなたかご教授お願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4288-6 - 2007/05/31 (木) 11:28:36 - FAS
ウイルスみならい　さんへ

なるほど、実際既に試されているのですね。これは失礼しました。
私も早速試して見ようと思います。

(無題) 削除/引用
No.4288-5 - 2007/05/31 (木) 10:34:18 - ウイルスみならい
FASさんへ

たしかにReverse Transfectionの方法はsiRNAのtransfectionのための方法ですが、応用して自分は現在、HepG2ではないのですが発現vectorをCOS7細胞にこの方法で導入しています。従来の方法に比べて、導入効率はいい印象を持っていますし、なにより一日早く実験に使用できるので好んで行っています。確かめたわけではないのですが、HepG2細胞でもこの方法で試してみる価値は十分にあると思います。

(無題) 削除/引用
No.4288-4 - 2007/05/30 (水) 13:54:49 - FAS
横からすみません、気になったもので。
私もHepG2を使ってます。いろいろ導入を試みていますが、入りにくい細胞ですね。
以前、エレクトロポーレーションで試したことありますけど、導入率はlipid系とそんなに変りませんでした。現在はタンパクの代わりにRNAで見るか、〜さんのおっしゃる様にIP-WBです（もちろん実験条件に依存しますが）。

ちなみに、Reverse Transfectionはベクターに適応可能でしょうか？確か、small RNAとかには有効だったような.....

Reverse Transfection 削除/引用
No.4288-3 - 2007/05/30 (水) 12:58:03 - ウイルスみならい
masaさん　

　HepG2細胞を最近まで使用していました。たしかに、LipofectaminやFugene６では導入しにくい印象がありました。以前、私はHepG2細胞にsiRNAをLipofectaminRNAiMaxで導入した経験があるのですが、そのときに行ったReverse Transfectionという方法をお試しになられたらどうでしょうか？この方法ではsiRNAは８０％以上の効率で導入できました。以来、私はこの方法をFugne6やFugeneHDに応用して、siRNAではなく発現プラスミドを導入しています。この方法の利点は、細胞をまく前に試薬を調整するので、従来の方法に比べて一日早く実験に使用できます。また、細胞に導入する際に細胞のコンフルエント具合を気にしていましたが、細胞が定着する前に試薬を加えるので効率が上がりやすくなると考えています。プロトコールはLipofectaminRNAiMaxの説明書に書いてあります。

(無題) 削除/引用
No.4288-2 - 2007/05/30 (水) 12:42:59 - 〜
HepG2は扱ったことがありませんが

293とHepG2に同じ条件でLuciferaseを入れたときの活性はどの位差がありますか？
mRNAやタンパク質の分解で制御されていないのであれば、
プロモーター活性の違いが転写量の違いになると思います。

その比の分HepG2をたくさんウェルにロードしてWBできないのであれば、
タグやそのタンパク質の抗体でIPしてから流すと濃縮できます。

培養細胞への遺伝子導入 削除/引用
No.4288-1 - 2007/05/27 (日) 08:36:16 - masa
現在、HepG2で試薬でプラスミドDNAを導入し一過性にタンパクを発現させようとしています。
これまでにinvitrogenやpromegaなどから発売されているlipofectamineやTfx-20など様々な試薬で試してみました。
しかしルシフェラーゼアッセイでは活性があるのに対し、western blottingでタンパクの確認をすると全くバンドが認められません。
同様の操作でHEK293に発現させるとWBでタンパクは確認できました。
HepG2でWBでバンドを出すためにはどうしたらよいでしょうか？
初心者です。どなたかご教授お願いします。
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