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プロテアーゼの仕業か、翻訳が止まったのか･･･ 削除/引用 No.4287-5 - 2007/05/29 (火) 23:23:28 - RS 助言、大変ありがとうございます。 市販の目的タンパク質特異的の抗体を用いて、ウエスタンブロットを行なったのですが、おそらく70 kDaに1本のバンドを検出する予定だったのですが、多数の非特異的バンドが検出してしまい･･･ 少し、抗体濃度をふって、再度行なう予定です。 という、少し進捗情報でした。 さて、皆さんが色々とご指摘頂いている内容は是非とも参考にしたいと思います。 あれから少々考えているのですが、この約10 kDaの違いは真か偽か･･･という事に関してですが、どうなのかは色々と試してみなければわからないものです･･･ ただ、今回得られた封入体を可溶化して、金属アフィニティーを用いた精製を行なって、それを解析に用いようかと思っています。 Ｎ末配列解析でちゃんとHisタグ付きなのか、若干目的タンパク質のアミノ酸残基がかぶるので、目的のものなのかどうかを見ようかと。 さらに、Ｃ末解析を行なうことにより、翻訳がしっかり進んだかどうかを見定めていこうかと考えています。 さらには、MALDI-TOFmassを使うのもありなのでは･･･と考えている段階で･･･ おおさんがおっしゃっているように、 > アミノ酸により計算できる分子量はSDSPAGEでは目安になりますが、あてにはできません。まず分解なのか、完全長のものがたまたま計算上のあたいより低い位置に来ているのか見定める必要がありますね。 記憶が確かならば、SDSの結合する量に依存する、つまりタンパク質でもアミノ酸残基の種類にも依存するのでは･･･という不安がありまして･･･ これからフォーラムの中に、この不安を解消する内容があるかを見ようかと考えています。 とその前に、mobilitomeさん、これは物凄く有力な情報、助かります。 V4さんの列挙されているプロテアーゼ、それに対する対処法、これまた今後のために助かります。

(無題) 削除/引用 No.4287-4 - 2007/05/29 (火) 14:55:26 - mobilitome 分裂酵母の全遺伝子にタグを付加してSDS-PAGEにおける移動度を網羅的に調べたところによれば、配列から予想される通りの移動度±10%に泳動されるものは全体の半数にしか過ぎないそうです（下の報告書のp.17（p.286））。 http://momo.tokyo.jst.go.jp/kisoken/crest/report/sh_heisei11/genome/yoshida.pdf

(無題) 削除/引用 No.4287-3 - 2007/05/28 (月) 13:25:49 - おお アミノ酸により計算できる分子量はSDSPAGEでは目安になりますが、あてにはできません。まず分解なのか、完全長のものがたまたま計算上のあたいより低い位置に来ているのか見定める必要がありますね。 プロテアーゼもいろいろなものが大腸菌で発現しているでしょうし、種類を見極めるなら各種のプロテアーゼインヒビターを単独で使いながら、その可能性を絞っていくのが普通、簡単に取れる手段だと思います。 おっしゃっている真核生物でそのたんぱく質をウエスタンとかで検出するとどれぐらいのサイズになるかなどの情報があれば、幾らか助けになるのでは? C末で作った抗体があればそれを使うのもてです。また全長を絶対に取りたい時はC末にタグをいれてそれを使って精製するというアイデアもよく使われます。 10キロあたりのデリーションというところから、そのあたりの配列をみて、配列特異的なプロテアーゼを検索するのは考えうる手かもしれませんが、助けになるかどうかは分かりません。

プロテアーゼ 削除/引用 No.4287-2 - 2007/05/28 (月) 12:39:53 - V4 大腸菌には,lon,ompT以外にセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼが多く含まれます｡したがって､上記のプロテアーゼ阻害剤を用いて抽出､精製の工程を行う必要があります｡今回はHis-tag精製なので、EDTAfreeのプロテアーゼcocktailを用いるとよろしいかと思います。 ただ気になる点が一点あります。 完全長よりも10KDa小さいバンドしかないのであれば、完全長が発現されていない可能性があります。通常分解を受けていても、完全長のタンパクは認められるはずですが。

大腸菌が持つプロテアーゼ 削除/引用 No.4287-1 - 2007/05/27 (日) 00:33:04 - RS 大腸菌Rosetta(DE3)を用いて、真核生物由来のタンパク質を発現しようとしています。 このとき、精製を容易にするために、N末端にHisタグを付加させています。 大腸菌発現ベクターを構築、塩基配列解析して、おかしなところがあるかないかを確認したところ、問題ありませんでした。 この大腸菌発現ベクターをRosetta(DE3)に導入し、 早速目的タンパク質を発現させたところ、 不溶性画分に目的のタンパク質が発現された様子でした。 というのは、抗Hisタグ抗体を用いてウエスタン解析をしたら、 色濃いバンドが１本検出されたからです。 しかし、アミノ酸配列から推定した分子量と比較すると約10 kDaほど低い位置にバンドが検出されました。 この後、目的タンパク質に対する抗体を用いて、ウエスタン解析を行おうと考えているのですが･･･ 実験結果に先立って、考察しておきたいのですが、 Rosettaなどのタンパク質発現用大腸菌はlonプロテアーゼやompT外膜プロテアーゼ欠損株･･･ もし、このタンパク質分子量の減少が何らかのプロテアーゼによるものだとしたら、どんなプロテアーゼが考えられるのでしょうか??

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