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(無題) 削除/引用 No.4282-13 - 2007/05/31 (木) 10:44:21 - 名無し 昨日書いた時に書き忘れていてそれをいま急に思い出したのでまた書きます。TCA沈殿でも他の方法でもそうだけど小さい蛋白質(10Kとか）とか分子量〜5000くらいのポリペプチドとかはすごい沈殿しにくい感じがする。ので蛋白質が断片とかになったやつを沈殿させるときはTCA沈殿することで逆に逃すことがあるかもしれないのでちょっと気をつけた方がいいかも。あと沈殿しにくい時、試料の蛋白質濃度濃くするとある程度はいい感じになる。目的が単に濃縮ならちょっとあわないかもしれないけど。今はいろんなプロトコールとかの本とかそういうのあって、それ見てやると確かにすごい楽でいいし、そのまま上手くいけばラッキーだけど、いつもそうとは限らないし、やっぱり自分の実験だし、実際にやってる人しか分からない部分って必ずあると思うから、必要に応じて自分なりにモディファイしたりとかして工夫して自分の実験に合うように最適化することも必要だとおもう。

(無題) 削除/引用 No.4282-12 - 2007/05/31 (木) 10:03:42 - Boston 私自身，アポトーシスの研究をしておりました。勿論カスパーゼやその基質の切断を経時的に解析していました。その際に細胞を遠心して回収した後，ソニケーションして、TCA 沈殿を行っていました．TCA 処理により、細胞内のプロテアーゼが失活するので、よけいなタンパク質の分解の心配もありません。このプロトコールは東大医科研の大海忍先生によるものです「抗ペプチド抗体実験プロトコール」。

(無題) 削除/引用 No.4282-11 - 2007/05/30 (水) 23:43:32 - pika 細胞数も液量もそろえてサンプル調整しているのですが、タンパク濃度がそろっていなくて、しかも薄いのでTCA沈殿しています。 薬剤により細胞にアポトーシスを起こさせ、経時的にサンプリングしています。 時間が経つと細胞が死んでしまって濃度があわないのかとも思ったのですが…。 半量のバッファーでやったときはあまりタンパクが取れませんでした。 あまり考えずにlysisにかける時間を倍量のときと同じで行ったためかとも思いしたが…。

(無題) 削除/引用 No.4282-10 - 2007/05/30 (水) 10:35:00 - YT 確かに、TCA沈殿は私が扱っている蛋白に関しては効率が悪い気がしますね。 他の蛋白に関してはどうか知りませんが。 しかし、これは裏を返せば、TCAで効率良く落せる蛋白を扱っている人にとってはある程度余計な蛋白を除けるということですかね。 　 ちなみに、私は非特異的に蛋白を沈殿させたい時にはｸﾛﾛﾎﾙﾑ・ﾒﾀﾉｰﾙ抽出を愛用してます。

TCA沈殿ってやらないとダメなんですか？ 削除/引用 No.4282-9 - 2007/05/30 (水) 08:12:25 - 名無し なんでTCA沈殿とかするのかがよく分かりません。もしTCA沈殿しないと出来ないくらい蛋白質濃度うすいとかそういうことなら、試料調製のときの液量とか少なくして濃いめの試料を作ればいいのではないかなどと思いました。またTCA沈殿や除酸の時、塩基性蛋白質っぽいやつとかみたいにTCA沈殿しにくい蛋白質はそこで失ってしまう恐れとかもあるし、界面活性剤沈殿して変な風になることあるし、特別に必要性がないならなにもTCA沈殿しなくてもいいと思う。単に液量で調整すれば蛋白質量をそろえる事はできるしその方が簡単で変なバイアスも入らないから均一にアプライできると思う。

アングルローターのせい？ 削除/引用 No.4282-8 - 2007/05/27 (日) 09:06:57 - Boston 私が以前所属していたラボでは、細胞 (1x10^6 以上) を 90 uL の PBS に懸濁、ソニケーション後、10 uL の100%TCA を加えていました。アングルローターの遠心機だとチューブの壁にタンパク質がへばりついてしまい、上清を除去する際に壁から剥がれてしまい、その分ロスしてしまいます。静置時間を長くして予めタンパク質をチューブの底にある程度集中させてから遠心するか、私のように細胞を懸濁するバッファーの容量を最小限にすれば良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4282-7 - 2007/05/26 (土) 21:15:39 - pika とりあえず、lysis bufferだけでTCA沈殿してみてやわらかいペレットができるかしらべてみます。 本来ならこのtritonによると思われるペレットはできないほうがいいんですよね？ちょっと根本的なことがわからなくなってきてしまって…。

(無題) 削除/引用 No.4282-6 - 2007/05/26 (土) 18:27:44 - a わたしは、TCA沈澱するときはDWで希釈します。 tritonは、共沈しやすく扱いが難しいので、出来るだけ希釈します。そうするとタンパク濃度が、低くなって、タンパクそのものが沈澱しにくくなるので、共沈剤としてDOCを添加します。 また、tritonのcroud pointがTCAで低下しています（？）から、遠心中の温度が低い方がtritonが溶けたままでいる割合が増加します。 と、想像しながらやっています。

triton 入ってます 削除/引用 No.4282-5 - 2007/05/26 (土) 14:48:11 - pika lysis bufferにはtrironが入ってます。 あのペレットはtritonだったんですか？ 吸わないほうがいいと思って、なるべく吸わないようにしているのですが…。 デオキシコール酸ナトリウムを入れておくとペレットがやわらかくなるのを防げるのですか？ メスアップはlysis bufferでしています。 tritonによって可溶化しているタンパクが含まれているかもしれないからlusis bufferを使ってアップするのがいいと言われました。 しかしこれによってさらにtritonが加わり、ペレットがやわらかくなってしまっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4282-3 - 2007/05/26 (土) 10:37:29 - a >TCAで沈殿させた後遠心して上清を除去するときに、ペレットがやわらかいのか >ピペットのチップの先に吸い付いてきてしまいます。 Lysis bufferに、tritonやNP40を使っていませんか？軟らかいペレットは、TCAで沈澱した界面活性剤ではないでしょうか。一緒に沈澱したタンパクを吸い取っているかもしれません。予め、試料にデオキシコール酸ナトリウム（0.08mg/ml　final）を添加しておいて,TCA沈澱する方が良いかもしれません。冷却できる遠心機を使う方がよろしいです。 >サンプルを分取した後、540μlにメスアップし、 は、Lysis bufferではなく、DWで希釈ですよね。 もし、triton入りのサンプルなら、bradfordで測定する所で、少し不安がありますがLysis bufferだけのコントロールは如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4282-2 - 2007/05/26 (土) 08:16:31 - チュー > 細胞のwhole cell lysateをCBB染色、western blottingしています。 > ブラッドフォードでサンプルのタンパク濃度を測定し、各サンプルから一定のタンパク量を含む分だけを分取しTCA沈殿して濃度をそろえてからSDSで泳動しています。 whole cell lysateをそのまま定量したらいかがでしょう？　SDSは定量結果に影響しますよね。SDSが入っているのなら直接アセトンで落とすとか。 > TCAで沈殿させた後遠心して上清を除去するときに、ペレットがやわらかいのかピペットのチップの先に吸い付いてきてしまいます。 これは私の場合起きません。違いは１００％TCAを使っているところ。あまりうまく行くとは思えませんが、１０％TCAでファイナル５％、常温で１０分でどうかなあ。

TCA沈殿 削除/引用 No.4282-1 - 2007/05/26 (土) 00:31:25 - pika 細胞のwhole cell lysateをCBB染色、western blottingしています。 ブラッドフォードでサンプルのタンパク濃度を測定し、各サンプルから一定のタンパク量を含む分だけを分取しTCA沈殿して濃度をそろえてからSDSで泳動しています。 しかし同じ量のタンパクを沈殿させているのに、CBBの結果をみると各サンプルのタンパク量がそろっていません。 TCAで沈殿させた後遠心して上清を除去するときに、ペレットがやわらかいのかピペットのチップの先に吸い付いてきてしまいます。 アセトンでwashした後のペレットの量もサンプルによってバラバラで、途中でタンパクも捨ててしまっているようなのですが…。 どうしたらうまくできるでしょうか？ サンプルを分取した後、540μlにメスアップし、そこに100%TCAを60μl加えてf.c10%TCAとしています。よく混ぜた後すぐ氷上で30min静置し、10min・15000rpmで遠心しています。上清を完全除去後アセトン1mlを加え軽く撹拌し10min・15000rpmで遠心し、上清除去後風乾させ、サンプルバッファーに溶かしています。

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