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(無題) 削除/引用 No.4280-5 - 2007/06/08 (金) 22:12:53 - 7878 lipid tissue mini kitに付属のQiazolはTrizolとほとんど組成は変わらないし、プロトコルもRNAとりさんのものと大して変わらないはずだから、改善効果は期待できないかもしれません。 ちなみに組織重量が100mgを超えていたりすると、カラムの「目詰まり」がおこり収量は極端に落ちるようです。この辺は大丈夫ですか？ 個人的にはホモジナイズ方法が主な原因があるのではと推察します。

(無題) 削除/引用 No.4280-4 - 2007/06/08 (金) 18:06:40 - 通行人 私の方法を参考までに書きます。収量は同じ程度で50ug/100mgBrain 私もトリゾール→RNeasyの手順で行っています �@100mg脳サンプル(マウスで1/4〜1/6）を1mlトリゾール中でホモジェナイズ （ペッスルを使用しています） �Aその後、シリンジを５回ほど通して、完全に組織を破砕します �Bクロロホルムを1/5vol加え、５分放置して、遠心 �C水層を移してイソプロ沈殿、70%EtOH Wash �D50μlの水にサスペンド、濃度測定（およそ100μgはとれます） �E100μg分のRNA（100μlにメスアップ）にRLTを350μlを加える（カラムのキャパが100μgなので限界までロードしています） �F250μlの100%EtOHを加える �GRNeasy miniにロード �H以下はプロトコール通り（収量は50μg） 8μg/10mgは厳しいと思いますが。初期サンプルを増やせば、良いのでは？ キアゲンに尋ねたところ、ホモジェナイズで収量は大きく変わるそうで、最も良いのは、ガラスビーズで破砕する方法のようです。 私は、収量を必要としていませんでしたので、他は追求していません

(無題) 削除/引用 No.4280-3 - 2007/06/08 (金) 03:13:29 - RNAとり 7878さんありがとうございます。 RNeasy lipid tissue mini kitを試してみる必要がありそうですね。 破砕の方法なども気になってはいるので、比較してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4280-2 - 2007/06/06 (水) 10:39:40 - 7878 マウス脳からのRNA抽出については，RNeasy lipid tissue mini kitでの経験がありますが，収量は説明書(5-20ug/10mg)と大して変わりませんでした（260/230 ratioは良くなかったですが）。 この時の条件は，ホモジナイズにはポリトロンホモジナイザーを使用し，あとは説明書通りQiazolを1mL加えて破砕して，200uLのクロロホルムを加え，遠心後，上清に70％エタノールを加えてカラム処理する方法です。 ソニケーターでの破砕はポリトロンやtissueruptorと比べてどうなのかわかりませんが，ホモジナイズする機材で収量に影響が出るとは考えられませんか？ それと，私の経験と集めた情報の限りでは，50％エタノールの使用は肝臓以外には収量その他の改善効果はないようです。

マウス脳組織からRNeasyによるRNA抽出 削除/引用 No.4280-1 - 2007/05/25 (金) 23:00:05 - RNAとり 現在マウス脳組織からRNeasy mini kitをつかってtotal RNAをとっています。 はじめにプロトコール通りに行ったのですが、カラムにより収量がバラバラで安定しませんでした。収量もあまり良くありません。(良い時は、RNA40ug/組織100mgくらい、悪いときはその半分くらい) そこで、 1)まずTrizolで溶解させ、(マイクロソニケーターを使っています） 2)Trizolの1/5量のクロロホルムを加え、12000rpm、4℃、20min遠心、 3)上清に等量のクロロホルムを加え、室温、12000rpm、2min遠心 4)上清に等量の70%エタノールを加え、RNeasyカラムを使って以下プロトコール通り。 この方法でカラム間のバラツキは少なくなりましたが、収量としては変わりません。Qiagenのマニュアルには脳だとRNA8ug/10mgくらいとれると書いてあるのですが。。。 以前肝臓からのRNA抽出のトピックがあった時には、50%エタノールを使って改善されていたようですが、どなたか脳組織からRNeasyをつかってRNAをとっている方はいらっしゃいますでしょうか？ また、50%エタノールを使う方が70%よりも一般的にいいのでしょうか(少なくとも逆に悪くなることはないのでしょうか？)?

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