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無事に抽出できました 削除/引用 No.4275-10 - 2007/06/14 (木) 20:33:05 - it addgeneに問い合わせて、別のロットの大腸菌を送ってもらったところ、無事にバンドが確認できました。 お答えいただき、ありがとうございました。

他の酵素を使ったのですが 削除/引用 No.4275-9 - 2007/05/26 (土) 17:09:48 - it 先ほど、Xho-1とPst-1を使ってみたのですが、Bgl-�Uの結果と同様に目的の位置にバンドが見えずに、10kb位にバンドが見えました。とりあえず、addgeneに問い合わせてみようと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.4275-8 - 2007/05/25 (金) 15:17:31 - it Bgl-�Uは、他のプラスミドをカット出来たので、酵素は失活していないと考えています。クローンは、トータルで6個拾いました。 ご指摘のように他の酵素でカットしてみようと思います。 皆様、ありがとうございました。

ご指摘ありがとうございます 削除/引用 No.4275-7 - 2007/05/25 (金) 14:35:37 - it TS様、gene様、メロン屋さん様、ご指摘ありがとうございます。 培養は、12時間くらい行いました。 普段は、10kbの位置にバンドが出ないのでご指導していただいている先生と首をひねっていました。 昔、インサートが入ったL4440をミニプレしたときは、きちんとバンドが検出されていましたが、今回は、ロットが悪かったのかもしれませんね。 大腸菌は、agarの状態で送られてきたので、おかしくなった可能性や間違ったものが送られてきた可能性も考えられるので、問い合わせた後、改めて書き込みさせていただきます。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4275-6 - 2007/05/25 (金) 14:26:03 - 〜 10kbがスーパーコイルなのか、ゲノムなのかが判るような流し方はしていますか？ まずは、no cutやXhoI,HindIIIなどと並べて流してみたらどうでしょうか

(無題) 削除/引用 No.4275-5 - 2007/05/25 (金) 14:20:00 - おお まず酵素を疑いますね。違う酵素を使ってみるか、ほかのプラスミドでそのBglIIが死んでないかといった所でしょうか。それを踏まえながら、購入先に手元にあるロットで変なことがおきてないか確認してもらうのもありかもしれません。 あとは、複数拾いましたか?一つだけだとはずれ引いたかもしれません。また、プラスミドの精製はどのようにやってますか。得られたプラスミド溶液になにか酵素活性を邪魔するものが入っている可能せいはないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4275-4 - 2007/05/25 (金) 14:13:09 - TS Addgene、わたしのラボも10ヶくらいプラスミドをまとめ買いしましたが、そのうちの１つのRE digestion siteがまちがっているという連絡を３ヶ月後くらいにもらいました（幸い使用してなかったので何も害はありませんでしたが）。non-profit companyだから、とは言いたくはありませんが、なにか間違ったものを送られた可能性も検討した方が良いのではないでしょうか？前の人のレスにあるように、REを含めて、系の正当性を確認できたら、addgeneに連絡するのが良いと思います。 だいたい、AGARに播かれたDH5aをLB plateにまき直して、シングルコロニーとって、ミニプレップしてるだけなのに、そのようなことになるのは何かがおかしいと考えた方が妥当だと思いますが。（このような実験の経験がそれなりにあればなおさらです）

(無題) 削除/引用 No.4275-3 - 2007/05/25 (金) 14:10:47 - gene plasmidをもった菌が「何らかの原因」で殖えなくて、抗生物質耐性菌ばかりが殖えた場合にそうなることがあります。 サイズの大きなバンドはゲノムDNAのコンタミで、普段は気にならない程度のものが、プラスミドがない場合それがとれてきやすいか、泳動で目立ちやすくなっているかだと思います。 培養のときの濁り具合はどうでしたか？　妙に殖えが悪くて、2 O/Nくらいし振ってようやく濁ってきたなんてときは、そういうこと、よくありがちです。 「何らかの原因」には、たとえばプラスミドが毒性のある遺伝子産物を発現してしまう、複製を妨げる配列がある（inverted repeatなんか）があります。また、T2などのファージのコンタミで溶菌してしまっていて、それでも長時間振っていると何かしら殖えてきて、そこからプラスミドをとろうとしてもそんな感じです。かつて企業を通じてdistributeされていたcDNA cloneが、T2ファージに汚染されていたこともありました。 購入した菌だということですが、まず供給元に問い合わせることです。原因が何であれ、プラスミドをとるための種菌を売っておきながら、取れないというのは、売った側に大きな責任があるでしょう。やり方なり、トラブルシュートなりを教えて、ちゃんとプラスミドが取れるようにアフターケアをするのが当然です。 生ものですから、流通の途中でおかしくなっている可能性もありますし（実際良くある）、ひょっとするとファージの汚染のような問題の発見に役立つかもしれませんし、供給元のためにも、他のユーザーのためにもフィードバックはした方がいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.4275-2 - 2007/05/25 (金) 13:11:16 - メロン屋さん ひとつの可能性ですが、制限酵素は大丈夫でしょうか？制限酵素のsiteが壊れている可能性も？ 切れるとわかっているポジコンはとりましたか？ 10kbpのバンドは、切れてないとしたら、plasmidのスーパーコイルじゃないですかね〜？？

ミニプレ後にバンドが検出できません 削除/引用 No.4275-1 - 2007/05/25 (金) 11:39:33 - it 初歩的な質問で申し訳ありません。 自分のまわりの方々にも聞いたのですが、分からないためご質問させていただきます。 addgeneという会社からアンピシリン耐性遺伝子をもつL4440というプラスミド(2.7kb)を購入しました。 http://www.addgene.org:8080/pgvec1?f=c&identifier=1654&cmd=findpl HT115という線虫のRNAi実験に用いる大腸菌に形質転換する必要があるのですが、DH5αに形質転換された状態で送られてきたため、LBプレート(amp 50μg/ml)にまきシングルコロニーにし、LB liquid (amp 50μg/ml) で培養後、普段と同様にプロメガのキットでミニプレをしました。 Bgl-�Uでカット後、電気泳動しプラスミドを確認しようとしたのですが、目的の位置にバンドが検出されず、10kbの位置にバンドが検出されました。 このバンドが何であるかも分かりません。 コピー数が低いことも考えられるので、クロラムフェニコールを加える方法も試したのですが、同様の結果でした。 何かお気づきの点がございましたらご指摘をお願いします。

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